BIOCHIMICA DELLE PROTEINE  

Prof. Alessandro Aliverti, Prof. Martino Bolognesi, Prof. Saverio Minucci, Prof. Maria Antonietta Vanoni, Prof. Giuliana Zanetti, Dr. Nedda Burlini, Dr. Marco Nardini.

La comprensione dettagliata delle relazioni struttura-funzione delle proteine e’ un passo fondamentale ed essenziale per la delucidazione di tutti i processi cellulari. L’ inizio della cosiddetta “era post-genomica” offre l’ entusiasmante opportunita’ di identificare nuove funzioni, nuovi meccanismi regolatori ed interazioni tra proteine con il risultato ultimo di una migliore e piu’ profonda comprensione dei meccanismi molecolari che controllano le funzioni cellulari, che, in buona parte, sono mediate da cambiamenti conformazionali a seguito di interazioni proteina-proteina o proteina (enzima)-ligando. Tali fenomeni possono essere studiati mediante approcci biochimici che permettono di descrivere la termodinamica e la cinetica del processo in esame. Gli studi meccanicistici di nuovi enzimi costituiscono un altro settore della ricerca contemporanea particolarmente importante per le ricadute in campi che vanno dalla scoperta di nuove attivita’ catalitiche, all’ ingegnerizzazione di enzimi con nuove attivita’ e alla progettazione razionale di farmaci da usare per combattere malattie in rapida diffusione. Questa Unita’ di Ricerca e’ formata da quattro laboratori che si concentrano su tre aspetti particolari della scienza delle proteine e, piu’ precisamente: a) definizione dei meccanismi di reazione e di regolazione in enzimi al duplice scopo di contribuire alla comprensione del macchinario catalitico della cellula e di gettare le basi per la progettazione razionale di farmaci per combattere malattie mortali tra cui la tuberculosi e la malaria; b) cancro; c) cammini metabolici. I laboratori sono forniti della strumentazione e delle competenze per utilizzare, nell’ ambito dei diversi progetti, un’ ampia gamma di tecniche di: biologia molecolare e cellulare, espressione (eterologa) di proteine e loro purificazione, ingegnerizzazione di proteine, analisi cinetica (in anaerobiosi) allo stato stazionario e pre-stazionario (cinetica rapida), spettroscopia di assorbimento e fluorescenza. Inoltre, attraverso collaborazioni, tali approcci sono complementati da altri di tipo strutturale e spettroscopico.     

Linee di Ricerca:

1. Enzimologia

Curti, Zanetti, Vanoni, Aliverti, Pandini, Caprini.

1.1 Trasferimento elettronico in ossidoriduttasi dipendenti da flavina e centri ferro-zolfo

I cofattori flavinici e i centri ferro-zolfo sono i due piu' importanti cofattori utilizzati nelle reazioni di ossidoriduzione in tutti gli organismi viventi. Ciononostante le relazioni precise tra l' intorno del dato cofattore e la direzione e la velocita' del trasferimento elettronico tra piridin nucleotidi (NADP(H) o NAD(H)) e cofattori flavinici e tra cofattori flavinici e centri ferro-zolfo sono ancora in larga misura sconosciuti. I nostri laboratori si occupano di questo problema biologico fondamentale mediante lo studio dei processi di trasferimento elettronico in enzimi flavina-dipendenti di diversa complessita' e utilizzando una serie di approcci complementari quali la mutagenesi sito-diretta, titolazioni redox, cinetica rapida e metodi computazionali. Attualmente sono in corso di studio:

1.1.1. La glutammato sintasi batterica NADPH-dipendente, un enzima complesso che opera ossidando il NADPH e trasferendo due equivalenti di riduzione al 2-imminoglutarato generato dall' addizione dell' ammoniaca (rilasciata dalla L-glutammina) al 2-ossoglutarato. Il trasferimento elettronico dal sito di ingresso degli elettroni (il cofattore FAD sulla subunita' minore, b) al sito di uscita (la molecola di FMN sulla subunita' maggiore, a) e' mediato da tre diversi centri ferro-zolfo ( un centro [3Fe-4S] e due centri [4Fe-4S] a basso potenziale) che formano una catena di trasporto elettronico tra le flavine.

1.1.2  Le ferredossine e ferredossina-NADP+ riduttasi vegetali, un sistema redox coinvolgente centri flavinici e ferro-zolfo in proteine separate, sono un soggetto ideale per lo studio dei processi di trasferimento elettronico intermolecolare tra proteine, di riconoscimento molecolare e di specificità enzima-substrato, grazie alla disponibilità di numerose isoforme e proteine chimeriche. Dopo aver fornito una dettagliata descrizione della struttura e delle proprietà di varie FNR fotosintetiche, stiamo attualmente studiando le relazioni struttura-funzione della isoforma non-fotosintetica, la FNR di radice di mais, mediante ingegneria proteica e cristallografia ai raggi-X in collaborazione con P. Andrew Karplus (Oregon State University, Corvallis, U.S.A.).

1.2  Controllo e coordinamento della catalisi nella glutammato sintasi, una amidotrasferasi dipendente da flavine e centri ferro-zolfo

Vanoni, Caprini.

Una caratteristica peculiare delle glutammato sintasi (GltS) e' lo stretto controllo delle attivita' catalitiche che hanno luogo al sito glutammina amidotrasferasico ( o glutamminasico) e al sito sintasico (nella subunita' a dell' enzima batterico, NADPH-dipendente, NADPH-GltS) e nella singola catena polypeptidica che forma la glutammato sintasi ferredossina-dipendente (Fd-GltS) di pianta. I dati a disposizione indicano che il legame del 2-ossoglutarato al sito sintasico e la riduzione del cofattore FMN e del centro [3Fe-4S] (entrambi al sito sintasico), oltre che il legame della ferredossina ridotta alla Fd-GltS, causano cambiamenti conformazionali limitati ma significativi all' interno del sito glutamminasico situato ad una distanza di 30 A dal sito sintasico stesso. La cristallografia ai raggi X ha mostrato come i siti glutamminasico e sintasico della GltS sono collegati da un tunnel intramolecolare per il trasferimento dell' ammoniaca e hanno indicato quali residui potrebbero essere coinvolti nel meccanismo di segnalazione (e attivazione) tra i siti catalitici della presenza dei substrati e del corretto stato di ossidoriduzione dei cofattori. Siamo ora impegnati a identificare il ruolo esatto dei singoli residui amminoacilici in tale meccanismo regolatorio mediante mutagenesi sito diretta della subunita' maggiore della NADPH-GltS e della Fd-GltS.

1.3 Risoluzione della struttura tridimensionale della glutammato sintasi mediante tecniche in soluzione e a singola

Vanoni, Caprini, Paravisi.

Non essendo riusciti sin ora ad ottenere cristalli dell’ oloenzima della glutammato sintasi batterica per la risoluzione della sua struttura ad alta risoluzione, stiamo impiegando tecniche strutturali a bassa risoluzione in soluzione o su singola molecola quali small-angle X-ray scattering (SAXS, con il Dr. Svergun, EMBL-Hamburg), microscopia elettronica a bassa temperatura (cryoEM, con il Dr. Nicolas Boiseet, Parigi) e microscopia a forza atomica (AFM, con i Dr. Milani e Podesta’, CIMAINA, Milano). Mentre misure di SAXS permettono di avere rapidamente informazioni strutturali, sebbene a bassa risoluzione, con la proteina in soluzione in condizioni di forza ionica, concentrazione di ligandi e temperatura comparabili a quelle in cui si effettua la caratterizzazione funzionale dell’ enzima, cryoEM e AFM sono tecniche a singola molecola che permettono di visualizzare la distribuzione delle particelle nel campione in funzione della loro massa e determinarne la forma, soprattutto nel caso di cryoEM. Combinando i dati di cryoEM e SAXS e’ stato possibile ottenere un modello a 9.5 angstroms dell’ oloenzima della glutammato sintasi che e’ presente in soluzione principalmente come esamero. Stiamo ora studiando l’ effetto di ligandi e altre condizioni ambientali (tampone, pH , temperatura, forza ionica) sullo stato di aggregazione della proteina con l’ obbiettivo di individuare condizioni utili per la suacristallizzazione.

1.4 Lisina demetilasi 1 (LSD 1) umana

Vanoni.

LSD1 e’ stata identificata dalla Dr.ssa E. Battaglioli (ora all’ Universita’ di Milano) come parte di un complesso di regolazione trascrizionale importante per il differenziamento neuronale ed e’ stata prodotta nell’ ambito di una collaborazione tra la Dr.ssa Battaglioli e il Prof. Mattevi (Pavia)  per la sua caratterizzazione strutturale e funzionale. Quest’ ultima si e’ avvalsa del nostro laboratorio dove sono state messe a punto le tecniche per la caratterizzazione cinetica dell’ enzima ed e’ stata iniziata la definizione della specificita’ di substrato. I risultati gettano le basi per allestire saggi high-throughput per la ricerca di inibitori e per l’ ulteriore definizione delle proprieta’ dell’ enzima che partecipa alla regolazione dell’ espressione genica demetilando la porzione N-terminale degli istoni H3.

1.5 Approcci computazionali per la determinazione dei meccanismi di reazione di flavoproteine

Vanoni, Caprini.

In collaborazione con i Dr. Fois e Tabacchi (universita’ dell’ Insubria –Como) abbiamo iniziato uno studio  teorico che mira a delucidare i meccanismi  con cui diverse flavoproteine catalizzano la deidrogenazione del substrato trasferendo gli equivalenti di riduzione al cofattore flavinico. L’ aumento della capacita’ di calcolo degli elaboratori moderni permette ora di affrontare la simulazione del sito attivo di un enzima e della reazione da esso catalizzata, fornendo informazioni non accessibile allo sperimentalista o che possono  guidare nuovi esperimenti. Recentemente, abbiamo dimostrato che e’ in effetti possibile costruire un modello realistico del sito attivo e della semi-reazione di riduzione della  D-ammino acido ossidasi, con descrizione quanto-meccanica degli atomi, nonostante l’ alto numero di atomi trattati. Stiamo ora estendendo gli esperimenti al caso, piu’ complesso, del flavocitocromo b2, una lattato deidrogenasi dipendente da FMN, e modello di una intera classe di flavoproteine, per cui il meccanismo di reazione non e’ stato ancora chiarito. Sulla base delle indicazione ottenute dalle simulazioni, stiamo progettando, producendo e caratterizzando varianti proteiche utili per verificare sperimentalmente i risultati delle simulazioni.

2. Nuovi bersagli per la progettazione razionale di farmaci

2.1 Enzimi di Mycobacterium tuberculosis che agiscono su tRNA: glutammil tRNA sintetasi and glutammil-tRNA riduttasi

Curti, Vanoni, Paravisi.

La glutammil-tRNA sintetasi e la glutammil-tRNA riduttasi catalizzano i primi due passaggi della biosintesi dell' acido d-amminolevulinico, il primo precursore comune della biosintesi dei cofattori tetrapirrolici, nella maggior parte dei batteri e nelle piante. La glutammil-tRNAsintetasi e' anche essenziale per la biosintesi delle proteine in tutti gli organismi. Alla luce delle differenze tra le glutammil-tRNA sintetasi batteriche e gli enzimi di mammifero e del fatto che la glutammil-tRNA riduttasi e' assente nei tessuti animali, entrambi gli enzimi sono bersagli ideali per lo sviluppo di inibitori specifici da usare come punto di partenza per lo sviluppo di nuovi antibiotici. Pertanto, abbiamo iniziato un programma di clonaggio ed espressione dei geni codificanti la glutammil-tRNA sintetasi e la glutammil-tRNA riduttasi di M. tuberculosis per la successiva purificazione e caratterizzazione dei due enzimi. In particolare, siamo interessati a studiare le interazioni di ciascune delle due proteine con i t-RNA substrato corrispondenti.

2.2 NADPH-ferredossina riduttasi e ferredossine di Mycobacterium tuberculosis: componenti del sistema di riduzione dei citocromi P450

Zanetti, Aliverti, Pandini, Pennati, de Rosa, Balconi.

La NADPH-ferredossina riduttasi (NFR) di M. tuberculosis è il prodotto del gene fprA, conservato nei micobatteri. E’ stato dimostrato che la NFR è una flavoproteina contenente FAD capace di ridurre in modo NADPH-dipendente ferredossine di diverso tipo. M. tuberculosis possiede un ricco e complesso metabolismo lipidico: nel suo genoma sono presenti venti geni codificanti citocromi P450, monoossigenasi che agiscono su substrati lipidici e steroidi. La NFR è stata proposta rappresentare, assieme ad una o più ferredossine, il sistema ossidoriduttivo che in M. tuberculosis fornisce equivalenti di riduzione ai citocromi P450. Oltre a questa funzione, la NFR potrebbe avere un ruolo nella biogenesi dei centri ferro-zolfo. In entrambi i casi, la NFR sarebbe un eccellente bersaglio di farmaci. Abbiamo ottenuto la struttura ad alta risoluzione della proteina in collaborazione con Andrea Mattevi (Università di Pavia) e realizzata un’estensiva caratterizzazione delle sue proprietà catalitiche. Recentemente, in collaborazione con il Dr. Vinod Bhakuni (Central Drug Research Institute, Lucknow, India), sono stati studiati in dettaglio i fattori chimico-fisici che influenzano la conformazione nativa della NFR e il suo processo di ripiegamento. E’ in corso di studio la reazione dell’enzima con NADPH e NADH in condizioni di stato pre-stazionario, con l’identificazione delle specie intermedie coinvolte e la misura delle costanti di velocità dei singoli passaggi del meccanismo catalitico, in collaborazione con il Dr. Giovanni Gadda (Georgia State University, Atlanta, U.S.A.). E’ oggetto di studio anche il coinvolgimento di specifici residui nella catalisi mediante ingegneria proteica.

2.3 Ferredossine:NADP+ riduttasi e relative ferredossine partner di Toxoplasma gondii e Plasmodium falciparum

Zanetti, Aliverti, Pandini, Balconi, Pennati, de Rosa.

Gli Apicomplexa sono un phylum di protisti parassiti, che includono T. gondii e P. falciparum. Questi organismi contengono un peculiare organello, detto apicoplasto, correlato ai plastidi vegetali non-fotosintetici. E’ stato dimostrato che l’apicoplasto è essenziale per la virulenza, e di conseguenza le proteine in esso localizzate sono considerate attraenti bersagli per nuovi farmaci antiparassitari. Abbiamo dimostrato che l’organello contiene una ferredossina-NADP+ riduttasi (FNR) e una ferredossina (Fd) in grado di formare un complesso proteina-proteina ossidoriduttivamente attivo. Il ruolo metabolico della coppia FNR/Fd di P. falciparum è stato studiato in collaborazione con Frank Seeber (Phillips University, Marburg, Germany) and Joachen Wiesner (Justus-Liebig University, Giessen, Germany), mostrando che il sistema FNR/Fd è in grado di veicolare elettroni dal NADPH a LytB, un enzima coinvolto nella biosintesi degli isoprenoidi. Il processo di riconoscimento molecolare tra FNR e Fd di Apicomplexa è stato investigato mediante proteolisi limitata e ingegneria proteica. La struttura tridimensionale della FNR di P. falciparum è in corso di studio mediante cristallografia ai raggi-X in collaborazione con Martino Bolognesi e Mario Milani.

3. Alterazioni della cromatina nei tumori

Minucci, Prudenziati, Marinelli, Del Zuffo, La Salandra.

Le nostre attivita' di ricerca hanno come obbiettivo lo studio della perdita di regolazione della struttura e funzione della cromatina nel cancro per due ragioni principali:
a)      Sta diventando sempre piu' evidente che  la  perdita di  regolazione degli agenti modificatori della  cromatina gioca un ruolo critico nella genesi dei tumori.
b)      L' uso di "farmaci potenziali" che interferiscono con gli enzimi che modificano la cromatina (istone deacetilasi, DNA metiltrasferasi) possono avere effetti positivi nel trattamento clinico di pazienti affetti da cancro. In effetti, molte molecole sono gia' in fase di sperimentazione clinica.
Quindi, vi e' ora una reale opportunita' di compiere un' analisi meccanicistica ("per comprendere come le cose succedono") che puo' essere immediatamente applicata per migliorare il trattamento dei pazienti ("per cercare di cambiare le cose, quando sono andate storte"). In particolare, ci stiamo concentrando sulla funzione delle istone deacetilasi in cellule sane e cancerose nella speranza di sfruttare la conoscenza dettagliata del loro meccasnismo di azione per migliorare l' impiego di inibitori delle istone deacetilasi nella terapia antitumorale.

4. Metabolismo della vitamina D3 in cellule vegetali. Biosintesi, regolazione e caratterizzazione di idrossilasi

Burlini.

Molte piante, tra cui il Solanum malacoxylon, contengono quantita' variabili di vitamina D₃ e dei suoi derivati idrossilati: 25-idrossi vitamina D₃ e 1a,25 diidrossi vitaminaD₃ (1a,25(OH)₂D₃). 1a,25(OH)₂D₃ e' essenziale per il mantenimento dell' omeostasi di calcio e fosforo negli animali, mentre il suo ruolo fisiologico nelle piante deve ancora essere definito. Dati preliminari sono in accordo con l' ipotesi che 1a,25(OH)₂D₃ abbia un ruolo nel metabolismo del calcio nelle piante come negli animali. E' in corso un progetto di studio del ruolo metabolico dell' 1a,25(OH)₂D₃ e della via metabolica a cui appartiene, basato sulla determinazione dei livelli dei diversi metaboliti della vitamina D₃ in cellule vegetali in diverse condizioni sperimentali.

5. Biologia Strutturale delle Proteine

5.1 Co-repressione della trascrizione genica da parte di CtBP3

Bolognesi, Nardini, Ricagno.

CtBP3 è una proteina di circa 50 kDa che agisce come co-repressore della trascrizione genica nel nucleo cellulare. Essa, inoltre, può essere coinvolta nella vescicolazione della membrana del Golgi, probabilmente grazie alla sua attività aciltransferasica. Nel nucleo cellulare CtBP3 lega NAD(H), ed agisce sotto forma di dimero favorendo il reclutamento di deacetilasi di istoni, di selezionate proteine che legano il DNA e di enzimi, formando così un complesso multiproteico di 1.6 MDa capace di modificare la struttura della cromatina. CtBP3 è anche coinvolta in innumerevoli processi cellulari correlati allo sviluppo ed alla tumorigenesi. I nostri studi cristallografici hanno come obiettivo la caratterizzazione sia dell’attività di co-repressione trascrizionale, sia dell’attività enzimatica di CtBP3, attraverso l’analisi strutturale di complessi proteina-proteina, proteina-cofattori, e dei loro meccanismi di riconoscimento. In collaborazione con l’Istituto Mario Negri Sud (Italia), e l’Università odiSydney (Australia). 

5.2  Strutture e meccanismi di riconoscimento in emoproteine di microorganismi

Bolognesi, Milani, Nardini.

Il fold caratteristico delle globine (sandwich di 3-su-3 a-eliche) risulta largamente modificato nella famiglia delle “emoglobine troncate” recentemente scoperta (trHb, a sandwich di a-eliche 2-su-2). Stiamo esaminando attivamente le strutture di trHb da varie fonti, in particolare da Mycobacterium tuberculosis, in cui due diverse trHb risultano essenziali per la sopravvivenza del micobatterio. I nostri studi si focalizzano sulle proprieta’ di un tunnel che attraversa la matrice proteica, caratteristico di alcune trHb, che potrebbe fungere da canale per la diffusione di ligandi biatomici dell’eme (O₂, NO, CO). In accordo con il possibile ruolo difensivo nei confronti dello stress nitrosativo prodotto dai macrofagi, una delle trHb di M. tuberculosis ha mostrato una significativa attivita’ NO-diossigenasica. In questo contesto, il laboratorio ha recentemente risolto la struttura 3D della trHbP di Campylobacter jejuni, quale primo esempio di una trHb appartenente al gruppo III della famiglia stessa. Sono state individuate modifiche del fold specifiche, e correlate all’evoluzione delle trHb note. In collaborazione con il Centro di Eccellenza per la Ricerca Biomedica (Universita’ di Genova), con l’Universita’ di Roma Tre, con Laval University (Quebec, Canada), e l’Albert Einstein College of Medicine (N.Y., USA). 

Fig. Dettagli del sito di legame dell'eme nella Hb troncata di Campylobacter jejuni (colore blu) paragonata con l'Hb troncata dell'alga unicellulare Chlamydomonas eugametos.

5.3   Proprietà strutturali delle emoglobine esacoordinate

Bolognesi, Nardini.

Si è scoperto che la molecola proteica dell’emoglobina, conosciuta da lungo tempo, è ampiamente diffusa in phyla molto diversi (compresi batteri, funghi e piante), contrariamente a quanto si credesse inizialmente. Negli ultimi anni una sottofamiglia delle emoglobine ha dato vita a nuovi studi, soprattutto con particolare riferimento ad un nuovo meccanismo per controllare l’affinità per l’ossigeno. Tale meccanismo si basa sull’utilizzo del residuo distale His come ligando che compete con l’ossigeno per la coordinazione all’atomo di ferro del gruppo eme. Esempi di emoglobine esacoordinate sono la neuroglobina umana (una emoglobina esacoordinata specifica di determinate zone del cervello, coinvolta nella risposta all’ipossia), la citoglobina umana, l’emoglobina di riso ed alcune altre. Il fold tridimensionale classico delle globine è ampiamente conservato all’interno di questa sottofamiglia di emoglobine. Scopo della nostra ricerca è quello di supportare gli studi sulla funzionalità e sui meccanismi delle emoglobine esacoordinate, attraverso l’analisi delle loro strutture e la progettazione di mutanti. Un altro studio collegato a questo argomento è quello relativo alla mini emoglobina (soltanto 109 aminoacidi) appartenente al verme nemertino Cerebratulus lacteus. In questo caso, dopo aver determinato la struttura tridimensionale della proteina, ci stiamo focalizzando sulla progettazione e relativo studio di mutanti che provino il meccanismo di riconoscimento dell’ossigeno ed il suo legame al gruppo eme. Tale ricerca è svolta in collaborazione con il Centro di Eccellenza per la Ricerca Biomedica, Università di Genova (Italia), l’Università di “Roma Tre” (Italia), l’Università di Anversa (Belgio), l’Università di Mainz (Germania) e l’Università di Buenos Aires (Argentina). 

5.4 Cristallizzazione di proteine in larga scala

Bolognesi, Nardini, Milani.

La sfida posta dal periodo post genomico determina nuovi approcci al problema della cristallizzazione delle proteine, il principale "collo di bottiglia" della biologia strutturale a raggi X. Grazie alla possibilita' di produrre alcuni mg di proteine ricombinanti, la ricerca di condizioni di cristallizzazione ottimali si realizza in approcci paralleli, basati su un campionamento combinatoriale dello spazio di cristallizzazione, utilizzando micro/nano dispensatori robotici e l'analisi automatizzata di migliaglia di esperimenti di crescita dei cristalli. Un tale approccio e' quello utilizzato dal nostro gruppo in collaborazione con il Centro di Eccellenza CIMAINA (U. di Milano), basato sulla nostra precedente esperienza nella cristallogenesi di proteine, e sulle attuali risorse di hardware/software. Attualmente sono attive diverse collaborazioni inter-dipartimentali per testare condizioni di crescita di nuove target proteici. 

5.5 Proteomica strutturale su enzimi virali

Bolognesi, Bollati, Mastrangelo, Milani, Sorrentino.

Nel contesto del progetto Europeo FP6, il nostro gruppo sta perseguendo una linea di ricerca sulla proteomica strutturale degli enzimi virali coinvolti nella replicazione. Il progetto “Vizier” include 25 laboratori europei che cooperano per identificare enzimi virali che possono portare alla identificazione di nuovi target per lo sviluppo di farmaci antivirali. Il nostro gruppo e’ coinvolto nell’espressione, cristallizzazione e analisi della struttura a raggi-X di circa 10 nuovi target ogni anno. Fino ad ora nei nostri laboratori sono state determinate le strutture della metiltrasferasi del virus Meaban e quella dell’elicasi del virus Yokose (Flavivirus). La collaborazione si estende a 24 laboratori europei e piu’ direttamente al CNRS – Universita’ di Marsiglia (Francia).

Fig. Immagine della struttura del sito attivo della metil-transferasi del virus Meaban, in presenza di S-adenosil metionina  e di un modello del substrato RNA.

http://users.unimi.it/biolstru/Home.html

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