BIOLOGIA CELLULARE E BIOTECNOLOGIE IN LIEVITO

Prof. Concetta Compagno, Prof. Laura Popolo.

L’Unità di ricerca è interessata allo studio di vari aspetti della biologia cellulare di lieviti e funghi e della fisiologia microbica. Inoltre, l’unità studia la potenziale applicazione in campo biotecnologico delle conoscenze acquisite. L’interesse primario è focalizzato sulla caratterizzazione di bersagli molecolari per nuovi antimicotici o candidati per lo sviluppo di vaccini, sullo sfruttamento di microrganismi di interesse industriale per la produzione di biocarburanti, di proteine eterologhe e di prodotti rilevanti per l’alimentazione umana.

Linee di Ricerca:

1. Caratterizzazione molecolare di una famiglia di enzimi richiesti per la biogenesi della parete cellulare e la morfogenesi in lievito e funghi patogeni

Popolo, Ragni 

Le cellule di lievito e fungine sono circondate da una matrice prevalentemente polisaccaridica che funge da esoscheletro e contribuisce a mantenere la forma cellulare. Nel nostro laboratorio ci occupiamo di una famiglia di enzimi ancorati alla membrana plasmatica tramite un glicosilfosfatidilinositolo (GPI) e coinvolti nella biogenesi della parete cellulare. Poiché la formazione della parete è strettamente accoppiata agli eventi della morfogenesi cellulare, il nostro interesse è anche rivolto alla regolazione a vari livelli di questi enzimi durante le transizioni morfologiche tipiche del ciclo vitale di lieviti e funghi. Inoltre, siamo interessati ai funghi patogeni per l’uomo o per le piante, per il ruolo svolto dalla parete cellulare nell’interazione di questi microrganismi con l’ospite. La parete è ricca di enzimi e di proteine a funzione strutturale ancora poco studiate. La loro caratterizzazione potrebbe contribuire all’identificazione di bersagli molecolari per la scoperta di nuovi antimicotici oppure di candidati per lo sviluppo di vaccini o di nuovi metodi diagnostici. Il nostro interesse primario è rivolto allo studio delle proteine Gas della famiglia 72 delle glicosidi idrolasi che è costituita esclusivamente da proteine di origine fungina. Questi enzimi sono fondamentali per l’allungamento e il rimodellamento del glucano, il principale componente strutturale della parete. Per il loro ruolo, tali enzimi sono cruciali per il mantenimento dell’integrità e per determinare la forma cellulare. Nel nostro laboratorio utilizziamo tecniche bio-molecolari, genetiche, biochimiche e analisi  in microscopia a fluorescenza per caratterizzare le famiglie di proteine Gas e Phr rispettivamente del lievito gemmante Saccharomyces cerevisiae e del lievito dimorfico Candida albicans, quest’ultimo responsabile di infezioni nell’uomo. Recentemente abbiamo dimostrato una specializzazione di ruoli della famiglia multigenica GAS. Dei cinque geni di lievito, la coppia GAS1-GAS5 è richiesta per la formazione della parete durante la crescita vegetativa mentre la coppia GAS2-GAS4 è richiesta per la formazione della parte della spora e per la sua vitalità. Abbiamo in corso studi biochimici sull’attività enzimatica delle proteine ricombinanti Gas1-5. Recentemente abbiamo definito il ruolo dei domini della proteina Gas1 e identificato le posizioni dei sette ponti disolfuro intra-molecolari ivi presenti. Per delucidare il ruolo biologico delle proteine Gas nel ciclo vitale di lievito, intendiamo proseguire gli studi sulla loro localizzazione cellulare. Gas1-GFP è stata individuata nei lipid rafts della membrana plasmatica, nella regione del setto e nei bud scars dove la proteina persiste per diverse generazioni tramite un legame convalente con la chitina (vedi Fig.1). Abbiamo in corso diversi studi volti a caratterizzare a livello molecolare questo nuovo meccanismo di cross-linking che per ora sappiamo dipendere dalla presenza del GPI, dalla chitina sintasi III (Chs3p) e dagli enzimi extracellulari Crh1 e Crh2. Inoltre, intendiamo studiare il traffico di Gas1p dal Trans Golgi Network al bud-neck e il ruolo svolto dalle septine nel reclutamento di Gas1p in tale regione. Nei prossimi anni ci focalizzeremo sugli studi volti a determinare la localizzazione delle proteine omologhe a Gas1p  in C. albicans in vari stati morfologici (lievito, ifa, pseudoifa e clamidospora). Analizzeremo la funzione svolta da questa proteine nei fenomeni di adesione e invasione degli epiteli in collaborazione con altri laboratori. Abbiamo in corso una collaborazione con la Dott.ssa Carmela Gissi dell’Unità di Bioinformatica e Genomica comparativa per l’analisi filogenetica della famiglia 72. Inoltre il nostro gruppo intrattiene scambi e collaborazioni con vari laboratori sia europei che americani. 

Fig.1 Localizzazione di Gas1p-GFP in S. cerevisiae cells. Le freccie indicano il bud neck, la regione del setto e i bud scars. Modificato da Rolli, E.Ragni  et al. Mol.Biol.Cell 20:4856-4870 (2009). 

2. Risposta adattativa allo stress di parete in lievito e in funghi patogeni

Popolo, Ragni 

I danni alla parete cellulare costituiscono una minaccia per la vita delle cellule di lievito e fungine. Alcuni anni fa abbiamo contribuito a dimostrare l’esistenza di una via di salvataggio dai danni alla parete che coinvolge diverse vie di trasduzione di segnali attivate dall’indebolimento dell’esoscheletro polisaccaridico (review: L.Popolo, T. Gualtieri e E.Ragni, Medical mycology 39, 111-121, 2001). La risposta della cellula provoca la modificazione della composizione e architettura della parete al fine di prevenire la lisi. Studi successivi hanno dimostrato il coinvolgimento di putativi sensori dello stress di parete e la modulazione dell’espressione di un set di geni che costituiscono la cosiddetta “core cell wall stress response”. Sulla base dell’esperienza acquisita in particolare sui mutanti di parete gas1 e ccw12 di S. cerevisiae, stiamo analizzando la risposta allo stress di parete in funghi patogeni per l’uomo. Attraverso l’uso di DNA microarray si studieranno i cambiamenti su larga scala del profilo trascrizionale a tempi diversi dall’esposizione ad uno stress acuto della parete. Questi studi potrebbero fornire informazioni utili per la comprensione di fenomeni legati allo stress e per il disegno di nuove strategie terapeutiche. 

3. Studio del metabolismo del carbonio e produzione di biocarburanti in lieviti di interesse industriale

Compagno, Galafassi

L’analisi comparata del metabolismo della fonte di carbonio in lieviti di interesse industriale implica l’utilizzo di sistemi in cui è possibile monitorare accuratamente le condizioni chimico-fisiche e fisiologiche di crescita della popolazione, come avviene nelle colture in fermentatore (batch e coltura continua). In questo modo è possibile ottenere dati molto utili e predittivi per lo sviluppo dei processi industriali. Lieviti del genere Brettanomyces/Dekkera sono responsabili del deterioramento di alcuni vini. La causa risiede nella loro capacità di contaminare le cantine e nella loro capacità di convertire gli acidi fenolici, naturali costituenti del mosto e del vino, nei corrispondenti 4-etil derivati. Tali lieviti sono quindi in grado di crescere in un ambiente particolarmente “difficile” qual è il vino (scarsi nutrienti, alto tenore alcolico, ambiente acido, etc.). Lo studio delle loro caratteristiche fisiologiche e lo sviluppo di sistemi di modificazione genetica può rappresentare un modo per sviluppare strategie efficaci per il loro controllo nei vini. L’obiettivo principale che si intende raggiungere è quello di acquisire nuove e approfondite conoscenze sulla capacità di crescita e metabolica di questi lieviti allo scopo di sviluppare strategie di identificazione e controllo di questo lievito nei processi di vinificazione. Questi studi hanno infatti il fine di sviluppare interventi di controllo microbiologico di processi industriali tradizionali, come le fermentazioni vinarie mediante strategie innovative. Questi lieviti mostrano inoltre la capacità di utilizzare fonti di carbonio alternative (pentosi e quindi derivati della cellulosa) , che li rende interessanti per la produzione di etanolo.  Studi volti al loro utilizzo per lo sviluppo di processi di produzione di etanolo da fonti rinnovabili sono in corso. 

4. Studio della risposta allo stress in lieviti di interesse industriale

Compagno, Galafassi

Caratteristica peculiare di D. bruxellensis è la sua capacità di sopravvivere in condizioni particolarmente “stressanti” quali quelle presenti nel vino (anaerobiosi, ambiente acido, presenza di etanolo). Il freddo è uno strumento ampiamente usato a livello industriale per il controllo dello sviluppo di specie microbiche, che quindi potrebbe essere utilizzato anche in enologia. La risposta allo stress da freddo è stata studiata bene in batteri e piante ma si conosce ancora poco in lievito. In Saccharomyces cerevisiae è stato dimostrato che la diminuzione della temperatura induce l’espressione di numerosi geni quali DAN/TIR, geni codificanti per mannoproteine di parete, i geni TIR1/SRP1, alcuni geni per heat shock proteins e geni implicati nel metabolismo del glicerolo e di carboidrati di riserva quali il trealosio e il glicogeno. Studi recenti hanno mostrato che cambiamenti nella fluidità della membrana cellulare sembrano essere il segnale primario che scatena la risposta, attraverso i classici circuiti che controllano la risposta generale allo stress. La nostra Unità di Ricerca ha quindi intrapreso uno studio sulla risposta di questa specie di lievito all’esposizione allo stress, in particolare allo stress osmotico e allo stress da freddo.

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