ESPRESSIONE GENICA, CICLO CELLULARE E STABILITA’ DEL GENOMA

Prof. Roberto Mantovani, Prof. Marco Muzi Falconi, Prof. Paolo Plevani, Dr. Monica Beltrame, Dr. Giuseppina Caretti, Dr.ssa Nerina Gnesutta, Dr. Luisa Guerrini, Dr. Federica Marini, Dr. Achille Pellicioli.

Nell’Unità operano diversi ricercatori la cui finalità principale è la comprensione a livello molecolare dei circuiti regolativi che controllano l’espressione genica, la proliferazione cellulare e la stabilità del genoma. Tali problematiche sono affrontate  sia in cellule umane che in organismi modello (lievito, zebrafish, Xenopus, topo etc.) a cui sono applicabili sofisticate tecniche genetiche che permettono lo studio di processi complessi, quali lo sviluppo, il differenziamento ed il controllo del ciclo cellulare. Tutti i gruppi di ricerca coinvolti sono interessati allo sviluppo di nuove strategie sperimentali ed approcci molecolari innovativi per la comprensione delle interazioni proteina-DNA e proteina-proteina alla base del controllo dell’espressione genica sia a livello di singoli geni che a livello dell’intero genoma.

Linee di Ricerca:

1. I meccanismi di checkpoint nella risposta a danni al DNA

Plevani, Muzi Falconi, Giannattasio,  Lazzaro, Puddu, Granata e Sertic.

In risposta a danni al DNA le cellule eucariotiche attivano un meccanismo di sorveglianza noto come checkpoint. Tale processo molecolare funziona come una cascata di trasduzione del segnale. Infatti, il segnale generato da uno specifico danno sul DNA viene trasmesso, attraverso l’azione di una serie di protein-chinasi, agli apparati che controllano la progressione del ciclo cellulare, l’apoptosi e la modulazione di numerosi processi del DNA (trascrizione, riparazione, replicazione e ricombinazione). Lo scopo del nostro progetto è di utilizzare una serie di approcci sperimentali di tipo genetico, biochimico e di proteomica per identificare i fattori coinvolti e determinarne l’attività biochimica, le interazioni reciproche e la funzione in vivo.

2. Il controllo della stabilità del genoma: interazioni funzionali tra checkpoints, replicazione e riparazione del DNA

Plevani, Muzi Falconi, Giannattasio, Lazzaro,  Puddu, Granata e Sertic.

I checkpoints sono dei meccanismi di sorveglianza che coordinano diversi aspetti del metabolismo del DNA con il controllo della proliferazione cellulare. La loro funzione è essenziale per il mantenimento della stabilità del genoma, dato che il malfunzionamento di tali meccanismi è alla base dell’insorgenza di tumori. Il nostro gruppo utilizza una serie di approcci genetici, biochimici e molecolari per comprendere come i checkpoints siano in grado di regolare diversi aspetti della replicazione e della riparazione del DNA, sia in cellule umane che in organismi modello, come il lievito. Utilizzando screening genetici specifici e tecniche dirette ad evidenziare interazioni proteina-proteina in vivo e in vitro, abbiamo dimostrato l’esistenza di interconnessioni fisiche e funzionali tra il checkpoint, meccanismi di riparazione e sintesi di DNA translesione. 

3. Ruolo fisiologico delle protein-chinasi haspine in lievito

Plevani, Muzi Falconi, Nespoli, Diani, Grianti.

Le haspine sono una famiglia di protein-chinasi descritta solo recentemente. Geni codificanti per haspine sono stati identificati in molti organisimi eucarioti, dal lievito ai mammiferi. Anche il genoma del microsporidia Encephaitozoon cuniculi contiene una sequenza omologa alle haspine, nonostante sia il genoma minimo eucariotico e codifica per solo 2000 geni. La presenza di un gene per l’haspina in un organismo con un una così drammatica riduzione del numero di geni, suggerisce un ruolo importante per le haspine. In Saccharomyces cerevisiae sono stati identificate due ORF, chiamate Alk1 e Alk2,  che codificano per omologhi dele haspine. Stiamo utilizzando diversi approcci genetici e biochimici per caratterizzare le funzioni di queste chinasi in cellule eucariotiche. Esperimenti iniziali suggersicono hce le haspine di lievito giochino un ruolo importante nel controllo della mitosi.

4. La riparazione dei legami covalenti tra le due eliche del DNA (interstrand cross-links) ed il pathway di Fanconi

Marini, Tumini

L’anemia di Fanconi (FA) e’ una sindrome ereditaria caratterizzata da un quadro clinico piuttosto complesso che comprende difetti nello sviluppo, progressiva insufficienza del midollo osseo ed elevata predisposizione allo sviluppo di tumori, specialmente leucemie mieloidi acute. A livello cellulare le proteine FA sono necessarie per la stabilità cromosomica e la resistenza cellulare  ad agenti chimici che determinano la formazione di legami covalenti tra i due filamenti di DNA (ICLs: interstrand crosslinks). Sulla base di studi di fusione di cellule somatiche, sono stati  fino ad ora identificati 13 gruppi di complementazione. Otto proteine FANC formano un complesso enzimatico nucleare, dotato di attivita’ ubiquitin ligasica. Il trattamento con agenti che causano ICL porta all’attivazione del complesso ed alla successiva mono-ubiquitinazione di due altre proteine FA: FANCD2 e FANCI. Secondo un modello generale, la via di segnalazione FA costituisce parte della risposta al danno al DNA innescata dagli ICLs, ma è ancora oscuro come effettivamente le proteine FA contribuiscano alla rimozione della lesione dal DNA. Gli ICLs causano mutazioni, riarrangiamenti cromosomici ed inibiscono sia la replicazione del DNA che la trascrizione. Per questo motivo gli ICLs sono particolarmente tossici per le cellule con alti ritmi di proliferazione e agenti chimici che provocano questi danni sono fra i farmaci citotossici più efficaci utilizzati in chemioterapia. Non si conosce ancora con precisione come gli ICLs vengano riparati negli eucarioti. Scopo della nostra ricerca e’ identificare e caratterizzare enzimi coinvolti nella riparazione degli ICLs e scoprire come l’attivazione del pathway di Fanconi porti alla finale rimozione del danno dal DNA, utilizzando sia cellule umane che il verme nematode C. elegans come organismo modello.

5. Le proteine HMG box nello sviluppo dei vertebrati

Beltrame, Cermenati

Siamo interessati a chiarire i ruoli svolti nello sviluppo embrionale da membri della superfamiglia delle proteine che legano il DNA tramite il dominio HMG box. Stiamo studiando le proteine cromatiniche HMGB, abbondanti proteine nucleari che regolano eventi di trascrizione e ricombinazione ma che agiscono anche come molecole extracellulari, e alcuni fattori trascrizionali della famiglia SOX. Le proteine SOX (SRY-related HMG box) si stanno rivelando dei regolatori chiave dello sviluppo, sono presenti in tutto il regno animale e agiscono come interruttori tessuto-specifici per la specificazione o il differenziamento del tipo cellulare. Diverse patologie umane sono associate a mutazioni in geni SOX. Tra queste, la sindrome HLT (Hypotrichosis-Lymphedema-Telangiectasia), legata a mutazioni in SOX18.
Il nostro principale sistema sperimentale e’ zebrafish (Danio rerio), un potente sistema modello per lo studio dello sviluppo dei vertebrati e delle malattie umane.

Fig. La parziale perdita di funzione di sox18 e sox7 in zebrafish causa fusioni anomale artero-venose, che richiamano le telangiectasie dei pazienti affetti da sindrome HLT. In embrioni soggetti a knockdown funzionale parziale di sox18 e sox7 (DMO, pannelli inferiori), le cellule endoteliali non differenziano in modo corretto, come evidenziato dalla ridotta fluorescenza della linea transgenica reporter per il recettore 2 del VEGF (flk1:EGFP). Sezioni semifini mostrano fusioni multiple tra i vasi assiali (la freccia bianca indica uno shunt artero-venoso). I pannelli superiori mostrano embrioni di controllo (ctrl). DA, aorta dorsale; PCV, vena cardinale posteriore. Vedi Cermenati et al. (2008) e Francois et al, Int J Biochem Cell Biol (2009), doi:10.1016/j.biocel.2009.08.017.

6. Analisi del ruolo dei geni p63 e Dlx nella patogenesi della Split Hand and Foot Malformation 4: attraverso un modello animale, Xenopus laevis, e la Talidomide, un farmaco teratogeno

Guerrini, Lo Iacono, Lopardo.

Circa 1/18000 individui è affetto da Split Hand/split Foot Malformation (SHFM), nota anche come ectrodattilia. In circa il 40% dei casi l'ectrodattilia è associata ad altre anomalie in patologie clinicamente distinguibili. Fra queste ricordiamo le sindromi EEC (Ectrodactyly, Ectodermal dysplasia and Cleft lip/palate), e LMS (Limb Mammary Syndrome). E'noto dalla letteratura che in queste sindromi sono implicati i geni p63, DLX5,DLX6 e Dactylyn. Inoltre mutazioni del gene p63 sono associate alla sindrome AEC (Ankyloblepharon Ectodermal dysplasia Clefting), caratterizzata da difetti degli epiteli, mentre una sindrome con caratteristiche simili (TDO, Tricho-Dento-Osseous), è causata da inattivazione funzionale del gene DLX3.
Le consistenti somiglianze tra queste sindromi suggeriscono che i geni implicati possano partecipare ad una comune sequenza di eventi regolativi che controllano lo sviluppo degli epiteli e degli arti.
Negli anni 50, sono state riscontrate malformazioni degli arti ed altri difetti dello sviluppo in neonati di donne che avevano assunto durante la gravidanza la Talidomide, un farmaco anti nausea. I nostri risultati preliminari indicano che, sia in cellule di mammifero sia negli embrioni di Xenopus, uno dei bersagli molecolari della Talidomide è la proteina p63. In questo progetto intendiamo verificare, su embrioni di Xenopus, che i geni DLX siano regolati da p63 attraverso la somministrazione della Talidomide e l'uso di diversi mutanti di p63 isolati da pazienti AEC e SHFM. Inoltre intendiamo identificare quali sono gli elementi regolativi che conferiscono ai
promotori dei geni Dlx la proprietà di essere regolati da p63. I nostri studi dovrebbero fornire un importante contributo alla conoscenza dei meccanismi molecolari che regolano lo sviluppo ed il differenziamento degli epiteli e degli arti e aiutare ad individuare strategie utili allo sviluppo di terapie che possano alleviare i sintomi in queste patologie ereditarie.

7. La biologia del fattore trascrizionale istonico NF-Y

Mantovani, Viganò, Donati, Gatta, Dolfini, Ceribelli.

L'espressione genica è controllata dal legame di fattori trascrizionali a regioni regolatrici di singoli geni; singoli fattori riconoscono specifiche sequenze di DNA nei promotori e negli enhancers e operano nel contesto di strutture cromatiniche complesse. Uno degli elementi più frequenti è il CCAAT box, legato dal NF-Y, un complesso composto da tre subunità-YA, YB, YC- che hanno la funzione di organizzare tridimensionalmente il promotore e reclutare cofattori trascrizionali. Il legame al DNA regolato durante il ciclo cellulare. NF-Y viene studiato dal punto di vista (i) dell'identificazione dei migliaia di siti di legame in vivo (ChIP on chip), (ii) dello studio delle modificazioni post-traduzionali delle sue subunità dopo vari tipi di stress cellulare, (iii) dei meccanismi di reclutamento di complessi attivatori e repressori sui promotori CCAAT.
In particolare, i risultati della ChIP on chip indicano che NF-Y è coinvolto nella espressione della maggioranza, se non nella totalità, dei geni umani. Ulteriori esperimenti indicano la sua importanza nello stabilire domini cromatinici attivi dal punto di vista delle modificazioni istoniche.

8. Studio dei target di p63 nei cheratinocitu umani

Mantovani, Viganò, Borrelli, Pozzi, Cordani.

p63, è un fattore trascrizionale regolato durante lo sviluppo, strutturalmente simile al soppressore tumorale p53. Alterazioni di p63 causano tre sindomi dominanti caratterizzate dall'associazione  variabile di ectrodattilia, displasia pilosebacea, oligodontia, labbro leporino, palatoschisi e dermatitite. In particolare, p63 sembra essere il fattore chiave nella biologia delle cellule staminali della cute. p63 lega il DNA in maniera sequenza-specifica nei promotori e negli enhancers dei geni controllati. L'estremità C-terminale di p63 contiene il dominio SAM che si trova in > 40 proteine coinvolte in processi di sviluppo, che è mutato in pazienti con AEC, ed è coinvolto nella repressione trascrizionale.
Uno dei problemi aperti riguarda Abbiamo identificato centinaia di geni che sono regolati da p63 tramite due approcci sperimentali. (i) In attivazione della proteina grazie a RNAi. (ii) Identificazione dei siti di legame grazie a esperimenti di ChIP on chip. Molti di questi geni sono regolati durante lo sviluppo e il differenziamento delle cellule epiteliali. Lo scopo del laboratorio è ora quello di studiare i geni target di p63 in cheratinociti umani, per ricostruire il complesso network di attivazioni e repressioni che permettono a p63 di giocare un ruolo fondamentale nello sviluppo del tessuto cutaneo.

9. Studi strutturali sul fattore trascrizionale NF-Y

Gnesutta, Mantovani

Dal punto di vista strutturale, NF-Y è un eterotrimero composto dalle subunità NF-YA, -YB e -YC, ciascuna contenente una regione “core” sufficiente per formare il complesso trimerico. Ad oggi si conosce che il dimero NF-YB/YC ha una struttura tridimensionale analoga al complesso istonico H2A/H2B, tuttavia non è ancora noto come NF-Y leghi il DNA ne induca la distorsione, in quanto tale specificità è mediata dalla subunità YA. Le ricerche sono indirizzate a determinare la struttura 3D del trimero delle regioni core di NF-Y in complesso con DNA che presenta il motivo di legame CCAAT. La ricerca prevede la purificazione del trimero e l’isolamento del complesso NF-Y/DNA, mediante colonne di affinità e gel filtrazioni successive. Gli esperimenti di cristallizzazione, determinazione ed analisi della struttura 3D, in collaborazione con l’Unità di Biochimica delle proteine, permetteranno di conoscere gli elementi strutturali che determinano la capacità di legare l’elemento CCAAT box, e di interpretare il ruolo funzionale delle modificazioni post-traduzionali delle regioni core di NF-Y.

10. Ruolo della chinasi PAK4 nel differenziamento di cheratinociti umani

Gnesutta, Calogero, Mantovani

La protein chinasi PAK4 controlla il rimodellamento del citoscheletro, le proprietà di adesione delle cellule, e regola diversi processi cellulari implicati nella trasformazione oncogenica. Inoltre, PAK4 è implicato in diverse vie fondamentali per il differenziamento e l’omeostasi dell’epidermide, in quanto interagisce con il recettore del Keratinocyte Growth Factor, regola la segnalazione del TNFR, la stabilità del fattore trascrizionale p63, promuove la sopravvivenza cellulare e protegge dall’apoptosi indotta da diversi stimoli. Nell’epidermide vi è un preciso controllo della proliferazione e del differenziamento dei cheratinociti, e disfunzioni in queste vie portano a displasie, difetti nella riparazione del tessuto, e crescita tumorale. In laboratorio analizziamo il ruolo di PAK4 nei cheratinociti mediante la sua inattivazione con la tecnica dell’RNAi e valutiamo i processi di differenziamento e di protezione dall’apoptosi indotta da stimoli come l’irraggiamento UV. L’analisi delle vie dei fattori trascrizionali p63 e NFkappaB, e l’analisi dei meccanismi di regolazione della chinasi ci permetteranno di chiarire i meccanismi molecolari che determinano le funzioni di PAK4 in questo tessuto.

11. Ruoli delle chinasi di ciclo cellulare nell’inattivazione del checkpoint da danno al DNA

Pellicioli, Ferrari 

Alcuni aspetti dei meccanismi richiesti per generare e trasdurre il segnale indotto da danno al DNA sono stati chiariti; tuttavia poco e’ noto circa il processo, chiamato recovery, che controlla la ripresa della progressione del ciclo cellulare dopo che le lesioni al DNA sono state riparate. Inoltre, in alcuni casi, le cellule possono ricominciare la progressione del ciclo cellulare anche se il danno al DNA non e’ stato completamente rimosso, attraverso un processo noto come adaptation. Ci proponiamo di investigare i meccanismi molecolari che controllano i processi di recovery e di adaptation studiando l’attivazione e l’inattivazione di alcune chinasi importanti del meccanismo di checkpoint in Saccharomyces cerevisiae. In particolare, stiamo analizzando il ruolo svolto da CDK1, una chinasi dipendente da cicline, e quello svolto dalla chinasi polo-like Cdc5 nel promuovere o inibire l’attivita’ di Rad53, uno dei regolatori principali del meccanismo di checkpoint da danno al DNA. A tale proposito, le Polo chinasi sono state coinvolte in fenomeni di checkpoint bypass in tutti gli eucarioti e sono spesso sovraespresse in alcuni tipi di tumori. Recentemente, abbiamo dimostrato che Cdc5 regola molteplici fattori  in risposta a un DSB; ora mediante un approccio di screening proteomico vogliamo identificare i bersagli regolati dalle Polo chinasi nel lievito e nell’uomo in presenza di danno al DNA. Queste informazioni potrebbero avere una applicazione pratica per disegnare specifici tools molecolari per la terapia contro il cancro.

12. Connessioni tra il checkpoint da danno al DNA e la ricombinazione

Pellicioli, Marini, Nachimuthu, Zana, Prandelli  

In tutti gli eucarioti, in risposta a danno al DNA le cellule attivano uno specifico meccanismo cellulare, chiamato checkpoint, per rallentare il ciclo cellulare e organizzare i meccansimi di riparazione del DNA. Tra i diversi tipi di danni al DNA, le rotture del doppio filamento (Double strand DNA breaks, DSBs) sono molto pericolose poiche’ frequentemente causano perdita di cromosomi e riarrangiamenti dannosi del genoma tramite ricombinazione. In particolare, tali eventi accadono durante l’adattamento a lesioni DSBs irreparabili o in specifici mutanti di checkpoint e sono molto comuni in linee cellulari tumorali. Recenti dati indicano che il checkpoint modula la ricombinazione tramite la fosforilazione di molteplici fattori ricombinativi. Vogliamo approfondire lo studio di come specifiche chinasi coinvolte nel checkpoint da danno al DNA controllano i fattori di ricombinazione, focalizzando le nostre indagini su alcune ricombinasi della famiglia di Rad54, coinvolte nella scelta della sequenza donor durante i vari processi di ricombnazione e nel processo di adaptation. Per fare cio’, utilizzeremo sistemi modello di lievito e specifiche linee cellulari di uomo.

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