Prof. Giovanni Bertoni, Prof. Gianni Dehò, Prof. Daniela Ghisotti, Prof. Paolo Landini, Dr. Federica Briani.

I batteri hanno sviluppato strategie sofisticate per adattarsi ad un ambiente variegato e variabile. La nostra ricerca è indirizzata principalmente all’analisi dei meccanismi regolativi alla base della versatilità fisiologica e metabolica dei batteri, con attenzione anche verso aspetti ambientali e biotecnologici. Un tema comune a molti dei nostri progetti di ricerca è l’adattamento dei batteri a stress ambientali. Questo comporta cambiamenti globali della fisiologia cellulare e dell’espressione genica. Lo studio di questi fenomeni fornisce un contributo significativo alla nostra conoscenza dei meccanismi regolativi globali e specifici e delle strategie molecolari di adattamento, e può avere rilevanti implicazioni ambientali, mediche e biotecnologiche.

Linee di Ricerca:

1. Integrazione trascrizionale del network di regolazione del plasmide TOL nell’ospite Pseudomonas putida 

Bertoni, Macchi, Sabbatini 

L’evoluzione ed espansione di network metabolici verso l’occupazione di spazi chimici più ampi comporta sia il reclutamento di nuove attività enzimatiche che la coordinazione della loro espressione con la fisiologia complessiva della cellula. I batteri che hanno sviluppato la capacità di degradare fonti di carbonio inusuali (ad esempio contaminanti aromatici) attraverso l’acquisizione orizzontale di segmenti catabolici e plasmidi offrono un’ottima opportunità di esplorare i meccanismi di impianto di network regolativi collegati all’espansione di attività metaboliche dell’ospite. Il batterio del suolo Pseudomonas putida mt-2 porta il cosidetto plasmide TOL pWW0, che conferisce alle cellule la capacità di mineralizzare toluene, m- e p-xilene. Questo plasmide è auto-trasmissibile e i geni catabolici sono mobili, la loro acquisizione conferisce al nuovo ospite un’aumentata attività catabolica. Apparentemente, l’espressione dei due operoni, upper e meta, per la degradazione del toluene codificati da pWW0 è soggetta ad un intricato circuito di regolazione installatosi nel network trascrizionale dell’ospite. Gli elementi di connessione si concentrano soprattutto sul promotore Pu dell’operone upper, da cui inizia la trascrizione quando P. putida mt-2 incontra i substrati aromatici. Pu è un promotore dipendente da s⁵⁴ che è attivato a distanza dal regolatore responsivo a toluene/m-/p-xilene XylR, codificato da pWW0 ed appartenente alla famiglia NtrC delle “enhancer binding proteins” batteriche. Oltre a s⁵⁴, altri elementi dell’ospite modulano Pu, tra cui la proteina IHF e il sistema PTS (Phosphoenolpyruvate:carbohydrate phosphoTransferase System). Inoltre, Pu sembra soggetto al fenomeno di competizione di fattori sigma in fase stazionaria. Questa linea di ricerca riguarda la caratterizzazione sul ruolo di “wiring” svolto da altri due fattori di co-regolazione dell’ospite identificati nel nostro laboratorio, TurA e PprA, ed il loro “interplay” con IHF e XylR, rispettivamente. La nostra ricerca su questo argomento si focalizza anche sul meccanismo alla base della trasduzione del segnale intramolecolare attraverso cambio conformazionale che conduce all’attivazione delle proteine XylR-like in seguito a legame con molecole aromatiche. Infine, i nostri interessi vanno oltre il collegamento di Pu con la fisiologia dell’ospite e ci prefiggiamo di studiare il ruolo globale di regolazione sia di TurA che di PprA, ed anche possibili funzioni insolite del s⁵⁴. La prospettiva a lungo termine della nostra ricerca in questo campo rientra nell’obiettivo generale di sfruttare le proprietà dei sistemi biologici per la prevenzione, il monitoraggio e la “remediation” dell’inquinamento ambientale. In questo contesto, il nostro laboratorio partecipa al progetto TARPOL (Targeting environmental pollution with engineered microbial systems á la carte) sponsorizzato dall’Unione Europea.

Figura: Modello per omologia della PNPasi di E. coli basato sulla struttura cristallografica della PNPasi di Streptomyces antibioticus (Symmons et al., Structure, 2000, 8:1215-1226). KH e S1 sono domini di legame all’RNA. La mutazione del residuo E81 interferisce nell’interazione dell’enzima con il degradosoma.
 

3. Identificazione di piccoli RNA del patogeno opportunista Pseudomonas aeruginosa

Bertoni, Briani, Dehò, Delvillani, Ferrara

La stragrande maggioranza dei piccoli RNA (sRNA) caratterizzati fino ad oggi è stata individuata in Escherichia coli, mentre pochissimi sRNA candidati sono stati individuati in specie filogeneticamente distanti. Ci proponiamo di identificare in modo sistematico gli sRNA di P. aeruginosa attraverso  l’utilizzo di una combinazione di approcci metodologici sperimentali di microbiologia molecolare e cellulare e di bioinformatica. Gli sRNA identificati attraverso la nostra analisi saranno poi oggetto di analisi funzionale. In particolare valuteremo il ruolo degli sRNA e dei loro geni bersaglio nella vitalità cellulare e nella virulenza e patogenicità di P. aeruginosa attraverso saggi di infezione in organismi ospite modello. Questo dovrebbe consentire di migliorare la comprensione delle basi molecolari delle patologie dovute ad infezione con P. aeruginosa e di scoprire nuove strategie impiegate da agenti patogeni per interagire con i loro ospiti. Questi risultati potrebbero portare all'identificazione di potenziali bersagli per farmaci antibatterici innovativi.

4. Identificazione e caratterizzazione di nuovi target per antibatterici e vaccini in Pseudomonas aeruginosa 

Bertoni, Macchi, Milani, Vecchietti 

Nonostante l’avvento degli antibiotici, le malattie infettive rimangono la causa maggiore di morte nel mondo. Questo problema è reso ancora più grave dall’insorgenza di ceppi batterici multi-resistenti e dall’insuccesso da parte delle industrie farmaceutiche di ottenere antibiotici con nuove modalità di azione capaci di eludere gli attuali meccanismi di resistenza. Il nostro laboratorio è partner del consorzio sponsorizzato dall’Unione Europea NABATIVI, costituito da sei istituzioni accademiche e tre SME con competenze complementari nel campo della patogenesi molecolare, ottima competitività nel campo della scoperta e ottimizzazione di nuovi farmaci e nello sviluppo preclinico. Il progetto NABATIVI si prefigge lo sviluppo di strategie innovative per l’identificazione e la validazione di nuovi target per antibatterici usando come organismi modello i batteri patogeni gram-negativi Pseudomonas aeruginosa e Burkholderia cenocepacia. Nell’ottica che prevenire un’infezione sia meglio di una cura antibatterica, la nostra ricerca è anche orientata all’identificazione di target per vaccini contro P. aeruginosa. Il nostro approccio è quello di mappare epitopi esposti attraverso analisi proteomica del “surfaceome” batterico, ovvero l’insieme delle proteine cellulari di superficie. Infine, nell’ottica di sviluppare strategie addizionali di prevenzione dell’infezione, stiamo anche studiando in P. aeruginosa i meccanismi di adattamento all’ospite alla base dell’instaurazione dell’infezione polmonare cronica. Sponsor italiani della nostra ricerca su P. aeruginosa sono “FFC - Italian Cystic Fibrosis Research Fundation, Verona” e “Fondazione Cariplo”.

5. Studio dell’espressione di geni di adesione e di formazione del biofilm in batteri Gram negativi

Landini, Tagliabue 

In questa linea di ricerca viene studiata la formazione del biofilm da parte di Escherichia coli e la regolazione dei geni coinvolti in questo processo. Tra i principali fattori di adesione ed aggregazione cellulare vi sono le fimbrie aggregative (curli) e polisaccaridi extracellulari (EPS) quali cellulosa e poli-N-acetilglucosamina; questi fattori, oltre a permettere la formazione del biofilm, sono coinvolti in importanti meccanismi quali la risposta a stress ambientali, la resistenza al trattamento con antibiotici, e costituiscono un fattore di virulenza. Il nostro lavoro si concentra sui meccanismi di regolazione genica di geni dei fattori di adesione, e di come la loro espressione venga co-ordinata con altri processi cellulari in modo da determinare una regolazione globale della fisiologia cellulare.

6. Studio di inibitori della formazione del biofilm

Landini, Antoniani 

Le proprietà fisiologiche dei biofilm batterici li rendono resistenti al trattamento con antibiotici, così da renderne difficile l’eliminazione anche dopo trattamenti prolungati nel tempo. Un processo legato alla resistenza agli antibiotici e anche al sistema immunitario dell’ospite è la produzione di una massiccia quantità di matrice extracellulare, costituita prevalentemente da polisaccaridi, che avvolge le cellule microbiche nel biofilm. La produzione di questa matrice è fortemente influenzata da una molecola segnale, il GMP-di-ciclico (c-di-GMP). Le c-di-GMP sintetasi batteriche non sono conservate nelle cellule animali e quindi nell’uomo; questo le rende dei bersagli interessanti per agenti mirati al controllo dello sviluppo dei biofilm batterici. Bloccando la formazione del biofilm, queste molecole inibitrici dovrebbero aumentare l’effetto degli antibiotici attualmente usati in terapia. In questo progetto vengono saggiati composti chimici utilizzando screening messi a punto nel laboratorio. Le molecole che mostrano attività contro il biofilm vengono caratterizzate per i loro meccanismi di azione utilizzando approcci genetici e biochimici.

7. Studio del riconoscimento specifico di promotori da parte delle diverse forme di RNA polimerasi batterica

Landini, Maciag 

In questo progetto ci interessiamo all’interazione con il DNA da parte dell’RNA polimerasi batterica associata a due diversi fattori sigma, sigma70, il principale fattore per il riconoscimento dei promotori in Escherichia coli, e sigmaS, un fattore sigma alternativo responsabile per la trascrizione di geni legati all’adattamento alle condizioni di stress. Stiamo studiando l’interazione delle due forme di RNA polimerasi, RNApol-sigma70 ed RNApol-sigmaS, con i promotori da loro riconosciuti, utilizzando una metodologia di determinazione dei trascritti specifici su tutto il genoma batterico (run-off micro-array, o RO-MA). Esperimenti di trascrizione in vitro verranno condotti utilizzando l’intero genoma come stampo, con RNApol-sigma70 o con RNApol-sigmaS. Questo esperimento fornirà precise informazioni sull’effetto sui meccanismi di riconoscimento dei promotori da parte dei due fattori sigma presi in esame. Esperimenti di RO-MA verranno poi ripetuti in presenza di regolatori trascrizionali per determinarne la specificità a livello di interazione con forme specifiche di RNA polimerasi.

8. Regolazione di un locus genico implicato nella biogenesi del lipopolisaccaride in Escherichia coli

Martorana, Dehò

Il lipopolisaccaride (LPS) è il componente principale dello strato fosfolipidico esterno della membrana esterna dei batteri Gram negativi. Recentemente, in collaborazione con il gruppo di ricerca di Alessandra Polissi, Università di Milano Bicocca, abbiamo caratterizzato un locus sul cromosoma di Escherichia coli che contiene due geni implicati nella biosintesi del Kdo, uno zucchero del core del lipopolisaccaride, e tre geni essenziali codificanti per altrettanti componenti della macchina di trasporto del lipopolisaccaride dalla membrana interna alla membrana esterna. Abbiamo dissezionato questo locus al fine di identificare i promotori e i meccanismi che regolano l'espressione di questi geni. L'analisi genetica e molecolare ci ha permesso di identificare tre regioni promotrici dislocate in tre siti distinti del locus; due di queste sono costituite da promotori multipli e diversamente regolati. Le ricerche future saranno mirate a comprendere il ruolo fisiologico di questa complessa organizzazione trascrizionale.  

9. Regolazione dell’espressione genica operata dalla proteina FurA nei micobatteri

Forti, Ghisotti

Le proteine Fur costituiscono una classe eterogenea di proteine regolatrici, ubiquitarie nei batteri, raggruppabili in diverse sottofamiglie con funzioni distinte tra cui il controllo dell’omeostasi del ferro, dello zinco, la risposta allo shock acido e allo stress ossidativo. In Mycobacterium tuberculosis è stata identificata la proteina FurA, codificata dal gene furA, che in tutti i micobatteri finora sequenziati precede il gene katG; katG codifica per una catalasi-perossidasi implicata nella resistenza allo stress ossidativo e quindi nella sopravvivenza del batterio nell’ospite. Sovrapposta al promotore di furA abbiamo identificato la sequenza operatore di FurA. FurA può legarsi ad essa solo in condizioni riducenti e  controlla così l’espressione dei geni a valle furA e katG. Per indagare se, analogamente a quanto avviene in altri batteri, FurA controllasse l’espressione anche di altri geni, abbiamo creato un mutante in furA di M. tuberculosis ed abbiamo condotto su di esso un’analisi mediante microarrays: dal confronto con il ceppo selvatico sono stati identificati due gruppi di geni, raggruppati in due regioni distinte del genoma, che risultano sovraespressi nel mutante, e quindi verosimilmente controllati da FurA. Una delle regioni sembra essere un operone, costituito da geni a funzione ignota, regolato da 2 promotori, uno dei quali regolato direttamente da FurA tramite un operatore altamente omologo a quello a monte di furA. L’altra regione comprende invece, oltre a furA e katG, il gene a valle di katG e i due geni a monte. Sono in corso analisi per chiarire la regolazione di questi geni a monte, che paiono essere controllati da FurA in modo indiretto. 

10. Controllo post-trascrizionale dell’espressione genica nei micobatteri

Forti, Ghisotti, Taverniti

Nei micobatteri il gene furA, localizzato immediatamente a monte di katG, è trascritto insieme a quest’ultimo in un unico trascritto. Due estremità 5’ sono state identificate, una a monte del gene furA e una seconda circa 50 bp a monte del codone di inizio traduzione di katG.

Abbiamo dimostrato per immunoprecipitazione della cromatina con anticorpi anti-RNA polimerasi che la seconda estremità 5’ non è creata da inizio della trascrizione, ma da processamento dell’RNA. La presenza di una sequenza ricca di purine, poche basi a monte del codone di inizio di katG, insieme alla traduzione del gene, contribuiscono alla stabilizzazione  del  trascritto.

Attualmente stiamo cercando di identificare la ribonucleasi responsabile del processamento del trascritto furA-katG. A tale scopo abbiamo costruito mutanti negli ortologhi di Mycobacterium smegmatis dei geni per le endoribonucleasi RNAsiE e RNAsiJ. Per il gene essenziale RNAsiE, abbiamo un mutante condizionale e risultati preliminari indicano che l’enzima è coinvolto solo indirettamente nella formazione del 5’ di katG, benché sia coinvolto nel generale processamento/degradazione del trascritto. RNAsiJ non risulta essenziale in M. smegmatis, esperimenti sono in corso per valutarne il ruolo nel processamento del trascritto furA-katG.

Inoltre la disponibilità di mutanti in geni coinvolti nel turnover degli RNA, permetterà di iniziare la caratterizzazione dei meccanismi e della funzione del processamento dei trascritti nei micobatteri. 

11. Analisi di mutanti in geni essenziali di Mycobacterium tuberculosis

Forti, Ghisotti

Allo scopo di identificare nuovi bersagli molecolari per lo sviluppo di farmaci antimicobatterici, stiamo cercando di creare una collezione di mutanti condizionali in Mycobacterium tuberculosis. Per fare questo intendiamo utilizzare la mutagenesi con trasposoni abbinata all’utilizzo di un promotore inducibile sviluppato nel nostro laboratorio. Il minitrasposone, che porterà il promotore inducibile, verrà rilasciato nel micobatterio mediante infezione con un batteriofago termosensibile. Tra le cellule che riceveranno il trasposone potremo individuare quelle con fenotipo condizionale, cioè la cui vitalità dipenderà dalla presenza dell’induttore, ed identificare successivamente il gene essenziale la cui trascrizione viene controllata dal nostro promotore inducibile.

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