GENOMICA FUNZIONALE DELLE PIANTE

Prof. Martin M. Kater, Prof. Chiara Tonelli, Dr. Katia Petroni.

Il gruppo della Prof.ssa Tonelli si occupa principalmente dello studio della regolazione genica in piante modello, come Arabidopsis thaliana, Zea mays e pomodoro. In particolare, la nostra attenzione si concentra su quattro principali linee di ricerca: 1) risposta a stress idrico e osmotico, 2) morte cellulare programmata in Arabidopsis; 3) sviluppo del seme e della pianta in Arabidopsis; 4) regolazione genica della biosintesi dei flavonoidi, una via metabolica secondaria specifica delle piante.

L’obbiettivo principale del gruppo di ricerca del Prof. Martin Kater è lo studio della regolazione a livello molecolare di geni che controllano lo sviluppo del fiore. Per effettuare queste ricerche sono utilizzati due organismi modello: Arabidopsis e riso. 4 sono  le linee di ricerca principali:(1) stiamo studiando geni che controllano l'identità del meristema florale e degli organi fiorali in Arabidopsis; (2) investighiamo geni che controllano  l'identità dei carpelli e degli ovoli in riso; (3) studiamo dei  fattori di trascrizione di base in pianta appartenenti alla famiglia TAF; (4) stiamo sviluppando le strategie di contenimento per prevenire l'espansione degli OGM. 

Linee di ricerca:

Gruppo Prof. Chiara Tonelli:

1. Risposta a stress idrico e osmotico

Tonelli, Galbiati, Cominelli.

Siccità, elevata concentrazione salina del terreno e basse temperature rappresentano alcuni dei fattori che limitano la distribuzione delle piante sulla terra e la loro coltivazione. Scopo della nostra ricerca è svelare i meccanismi che stanno alla base dell’adattamento delle piante agli stress abiotici, focalizzando la nostra attenzione sullo studio di specifici fattori trascrizionali di Arabidopsis, al fine di sviluppare strumenti e modi per migliorare la tolleranza delle piante di interesse agronomico agli stress idrico ed osmotico.

La nostra ricerca riguarda principalmente tre geni MYB coinvolti in diversi aspetti della risposta agli stress abiotici. In particolare, abbiamo dimostrato che il fattore trascrizionale AtMYB60, specifico delle cellule di guardia, è coinvolto nel controllo dell’apertura degli stomi e che i mutanti knock-out atmyb60-1 mostrano una riduzione dell’apertura degli stomi e della perdita d’acqua per traspirazione in condizioni di siccità, permettendo quindi alle piante di resistere allo stress idrico per un periodo di tempo maggiore. Il livello del trascritto di un certo numero di geni, molti dei quali coinvolti nella risposta agli stress, risulta essere alterato nel mutante. Abbiamo identificato il promotore minimo di AtMYB60, ovverosia una regione necessaria e sufficiente per l’espressione di AtMYB60 nelle cellule di guardia degli stomi, ed alcuni putativi regolatori che legano tale sequenza. I nostri dati indicano che AtMYB60 modula le risposte fisiologiche delle cellule di guardia e apre nuove possibilità per modificare la risposta degli stomi e migliorare la sopravvivenza delle piante in condizioni di siccità.

Inoltre, abbiamo identificato un fattore trascrizionale MYB (AtMYB90) che, se sovraespresso, aumenta notevolmente la tolleranza al sale in Arabidopsis e quindi potrebbe essere utilizzato per aumentare la tolleranza allo stress salino nelle piante di interesse agronomico. Alcuni geni coinvolti nella risposta agli stress, come ERD10, P5CS e RD22, sono fortemente attivati nelle piante che sovraesprimono AtMYB90 anche se cresciute in condizioni normali, indicando la presenza di uno stato permanente di attivazione della risposta agli stress.

Infine, il nostro gruppo si sta occupando dell’analisi del ruolo di AtMYB41, un fattore trascrizionale espresso solo in risposta a stress idrico e osmotico. Le piante che sovraesprimono AtMYB41 sono nane e presentano cellule piccole. Inoltre, esse mostrano un’elevata traspirazione ed un’aumentata sensibilità alla siccità, probabilmente dovuta alla presenza di rotture nella cuticola dell’epidermide. 

2. Morte cellulare programmata in Arabidopsis

Tonelli, Galbiati, Landoni.

La morte cellulare programmata (PCD) è un processo cruciale nello sviluppo e sopravvivenza della cellula, ma poco è noto riguardo a questo fenomeno nelle piante. Tra le inserzioni gene-trap della collezione EXOTIC (http://www.jic.bbsrc.ac.uk/hosting/exotic/index.htm), abbiamo identificato due mutanti che presentano un fenotipo caratterizzato dalla presenza di aree necrotiche sui cotiledoni e sulle foglie. Entrambi i mutanti crescono in maniera distorta e presentano le caratteristiche biochimiche e molecolari tipiche della PCD in corrispondenza delle lesioni necrotiche. Una delle linee presenta una mutazione puntiforme in un gene la cui identificazione tramite positional cloning è attualmente in corso, mentre una seconda linea è associata all’attivazione ectopica del gene Prn1 che promuove la PCD nelle piante. 

3. Sviluppo del seme e sviluppo vegetativo in Arabidopsis

Tonelli, Petroni,Calvenzani, Fornari.

Lo sviluppo del seme nelle piante dicotiledoni può essere divisa in tre fasi principali: i) la morfogenesi, che va dalla fecondazione al termine della fase di crescita per divisione cellulare; ii) la fase di maturazione, in cui vengono sintetizzati i prodotti di riserva, quali amido, lipidi e proteine; iii) l’embriogenesi tardiva, che è caratterizzata dall’essiccamento del seme, l’inibizione della germinazione prematura e la dormienza. Lo sviluppo in Arabidopsis è controllato da diversi geni che regolano diversi aspetti del processo, tra cui LEAFY COTYLEDON1 (LEC1), il primo fattore trascrizionale NF-Y isolato nelle piante. I nostri studi si concentrano sul gene LEAFY COTYLEDON1-LIKE (L1L), filogeneticamente vicino a LEC1e altri fattori NF-Y che controllano lo sviluppo embrionale. Scopo dei nostri studi è comprendere il loro ruolo e le possibili interazioni con altri fattori trascrizionali coinvolti nel controllo dello sviluppo del seme.

I nostri studi si focalizzano anche su fattori trascrizionali MYB e NF-Y che controllano diversi aspetti dello sviluppo vegetativo della pianta, quali lo sviluppo della radice, delle foglie e del fusto. Tra questi, AtMYB11 è un fattore trascrizionale espresso specificamente nei meristemi e primordi, i cui mutanti knock-out atmyb11-1 presentano germinazione e crescita accelerata, che porta a piante che fioriscono precocemente, con un maggior numero di internodi, fiori, silique, radici avventizie e laterali. Al contrario, piante transgeniche che sovraesprimono AtMYB11 presentano uno sviluppo rallentato rispetto sia a piante wild-type sia atmyb11-1. Ci proponiamo di definire il ruolo e i meccanismi molecolari attraverso i quali AtMYB11 e gli altri fattori trascrizionali in studio controllano lo sviluppo della pianta.

4. Biosintesi dei flavonoidi in mais, Arabidopsis e pomodoro

Tonelli, Petroni, Cominelli, Calvenzani.

I flavonoidi sono un vasto gruppo di metaboliti secondari aromatici con un range di importanti funzioni biologiche. Per esempio, antociani, proantocianidine e flobafeni sono flavonoidi responsabili dei pigmenti rossi, blu e marroni dei diversi organi delle piante. Nelle piante, essi servono come protezione dlla radiazione UV-B, difesa dall’attacco di patogeni, attrattiva per gli insetti impollinatori e risposta a diverse condizioni di stress, quali ferita, freddo e mancanza di nutrienti. Inoltre, i flavonoli sono componenti importanti nella dieta umana a causa della loro elevata capacità antiossidante. La regolazione della biosintesi degli antociani dipende da due famiglie di geni regolatori che codificano per fattori trascrizionali di tipo MYB e bHLH. Il nostro gruppo ha contribuito all’isolamento e caratterizzazione di diversi alleli di questi regolatori (Sn, Hopi, pl-bol3, pl-W22), avendone determinato la specifica espressione temporale e tissutale, la loro inducibilità da parte della luce ed il loro coinvolgimento in fenomeni epigenetici.

I nostri studi recenti sono volti a definire gli effetti benefici dei flavonoidi contenuti in mais e Arabidopsis nella protezione contro le malattie cardiovascolari e legate all’invecchiamento, tramite lo studio di sistemi modello, quali topo/ratto e linee cellulari, in collaborazione con laboratori europei coinvolti nel progetto europeo FLORA (www.flora-flavonoids.eu).
Stiamo inoltre caratterizzando i geni MYB e bHLH di pomodoro e mais coinvolti nella biosintesi dei flavonoidi e, in particolare, nella risposta a diverse qualità di luce e stress abiotici.

Gruppo Prof. Martin Kater:

1. Regolazione molecolare dello sviluppo del fiore in Arabidopsis

Kater, Gregis, Sessa, Dorca Fornell, Colombo.

La formazione degli organi riproduttivi in tutte le piante superiori è subordinata all'azione di una specifica sottoclasse di geni omeotici, in particolare di fattori trascrizionali di tipo MADS-box appartenenti alla classe C. L'espressione dei geni di classe C nei due verticilli fiorali più interni determina lo sviluppo di stami e carpelli mentre al di fuori del loro dominio di espressione si sviluppano gli organi del perianzio, quali sepali e petali. In Arabidopsis l’unico gene di classe C è AGAMOUS (AG). Il mantenimento dei domini di espressione di AG nei due verticilli di competenza necessita del coinvolgimento  dei corepressori trascrizionali LEUNIG (LUG) e SEUSS (SEU) ma il meccanismo molecolare della loro azione è ancora sconosciuto.
Noi abbiamo recentemente evidenziato con prove genetiche e molecolari che i fattori di tipo MADS-box, Short Vegetative Phase (SVP), AGAMOUS-LIKE 24 (AGL24) ed APETALA1 (AP1), collaborano durante i primi stadi dello sviluppo fiorale reprimendo AG nei due verticilli più esterni attraverso il reclutamento del complesso corepressore LUG-SEU. SVP, AGL24 e AP1 erano già noti come geni coinvolti nella transizione fiorale e nella determinazione del meristema infiorescenziale e fiorale.
Scopo principale della nostra ricerca è di fornire delucidazioni sui complessi meccanismi molecolari nei quali le diverse combinazioni dei fattori trascrizionali di tipo MADS, a livello di espressione, concentrazione e interazione, regolano i processi di sviluppo della pianta dalla transizione fiorale fino alla formazione del fiore.

2. Controllo dell’identità di ovulo e carpello in riso

Kater, Dreni, Jacchia.

Questa linea di ricerca si concentra sull'analisi funzionale dei geni responsabili dell’identità di carpelli e ovuli in riso. I geni omeotici  sono stati studiati intensivamente nella specie dicotiledone Arabidopsis. Questi studi hanno permesso l'identificazione di quattro geni estremamente simili quali AGAMOUS (AG), SHATTERPROOF 1 (SHP1), SHP2 e SEEDSTICK (STK). Dei quattro geni sopra menzionati STK controlla esclusivamente lo sviluppo dell’ ovolo mentre SHP1, SHP2 ed AG controllano anche l’identità e lo sviluppo del carpello. In questo contesto è importante notare che STK è l'unico di questi quattro geni che risulta espresso in modo specifico nell’ ovolo.  In riso ci sono quattro geni MADS-box che appartengono allo stesso clade di geni di AG: OsMADS3, OsMADS13, OsMADS21 ed OsMAD58. La funzione di OsMADS3 ed OsMADS58 durante lo sviluppo fiorale in riso è stata caratterizzata recentemente da Yamaguchi e colleghi (2006).  Il mutante per inserzione di T-DNA osmads3-3 ha pressoché tutti gli stami trasformati omeoticamente  in organi simili a lodicule. In più nel quarto verticillo si osserva un aumento del numero di carpelli. Le linee OsMADS58 RNAi mostrano uno sviluppo indeterminato degli organi fiorali, in particolare viene prodotto un set reiterato di organi composto da lodicule, organi chimerici stame/lodicula ed organi carpelloidi. Le nostre ricerche si concentrano sulla caratterizzazione funzionale di altri due geni di riso appartenenti al clade di AG: OsMADS13 e OsMADS21. Il nostro intento è quello di scoprire eventuali funzioni ridondanti come mostrato in Arabidopsis tra i quattro fattori di tipo MADS-box appartenenti al clade AG. Risultati preliminari indicano che OsMADS13 è un fattore MADS-box della classe D che controlla l’identità dell’ovulo.

3. Analisi molecolare e genetica dei fattori TAF in Arabidopsis

Kater, Kooiker.

L’inizio della trascrizione mediata dall’RNA polimerasi II richiede molti fattori trascrizionali tra i quali TFIID è il principale fattore di riconoscimento del promotore . TFIID è composto da fattori altamente conservati come le TATA-binding protein (TBP) e circa 14 TBP-associated factors (TAFs). Visto l’importante ruolo svolto dai TAFs nella trascrizione, queste proteine sono state studiate approfonditamente in lievito, Drosophila e uomo, ma le ricerche sono ancora carenti in pianta. Con il completamento del sequenziamento dell’intero genoma di Arabidopsis si è resa possibile la ricerca dei geni TAFs, dato che molti di essi mostrano dei domini aminoacidici conservati. Da queste analisi sul genoma di Arabidopsis sono stati identificati 20 putative TAFs (AtTAFs). Abbiamo allora analizzato la loro struttura proteica e la loro localizzazione genomica; il profilo di espressione ottenuto attraverso RT-PCR mostra che questi TAFs sono espressi in tutti i tessuti della pianta e questo concorda con il loro putativo ruolo nella trascrizione. E’ interessante notare che, diversamente dalle altre famiglie di fattori trascrizionali, non è evidenziabile amplificazione genica. Recentemente abbiamo pubblicato la caratterizzazione di AtTAF6, dove viene evidenziato come questo fattore controlla la crescita del tubetto pollinico. Nel nostro laboratorio è attualmente in atto la caratterizzazione funzionale di vari fattori TAF di Arabidopsis.

4. Contenimento dei trasgeni

Kater, Kooiker, Battaglia, Gregis.

Questa linea di ricerca è finanziata direttamente da un progetto dell’Unione Europea FP6 chiamato TransContainer.   La dispersione dei transgeni da raccolti geneticamente modificati a raccolti convenzionali ed organici  o a specie selvatiche resta una fonte di preoccupazione sia pubblica che scientifica in Europa.  La coesistenza di piante GM e non-GM può essere promossa attraverso la  messa a punto di strategie di contenimento del transgene. Al progetto TransContainer partecipano attivamente 15 partner appartenenti ad università ed istituti statali, SMEs ed un partner industriale. Scopo principale del progetto è creare i presupposti per una coesistenza sicura delle biotecnologie agrarie e del agricoltura tradizionale in Europa, permettendo così una maggiore competitività di questo settore. TransContainer vuole studiare e sviluppare delle strategie per il contenimento biologico. Noi stiamo sviluppando le strategie per controllare la  trasmissione dei transgeni attraverso polline e seme.

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