BIOLOGIA CELLULARE E NEUROANATOMIA

Prof. Silvia De Biasi, Prof. Laura Vitellaro Zuccarello, Dr. Alida Amadeo, Dr. Maria Enrica Pasini.

L'attività di ricerca si basa su un ampio spettro di moderne tecniche morfologiche di analisi (imaging microscopico ad alta risoluzione, microscopia in fluorescenza e confocale, microscopia elettronica) integrate da approcci di tipo biochimico e di biologia molecolare. In generale, le tematiche di ricerca si inseriscono in diverse aree delle neuroscienze e includono lo studio, dal livello microscopico fino a quello molecolare, di: a) sottopopolazioni neuronali e gliali, b) circuiti sinaptici, c) componenti della matrice extracellulare, in diverse stazioni del sistema nervoso centrale di mammifero (midollo spinale, talamo, neocorteccia, ippocampo, cervelletto) in condizioni normali e patologiche. A tal fine vengono impiegate tecniche neuroanatomiche in microscopia ottica, confocale ed elettronica, che consentono di ricavare anche indicazioni funzionali. Neuroni, glia e sinapsi sono identificati mediante l’espressione di molteplici marcatori molecolari (citoplasmatici, di membrana ed extracellulari), mentre i componenti della matrice extracellulare sono identificati grazie a specifici ligandi.

Linee di Ricerca:

1. Sclerosi Laterale Amiotrofica (SLA)

De Biasi, Vitellaro, Gioria, Pasini, Fontana

La Sclerosi Laterale Amiotrofica (SLA) è una malattia neurodegenerativa, ad eziologia tuttora sconosciuta, caratterizzata dalla perdita progressiva dei motoneuroni responsabili della contrazione della muscolatura volontaria. La dimostrazione che alcune forme di SLA familiare sono dovute a mutazioni del gene per l’enzima superossido dismutasi 1 (SOD1) ha permesso la creazione di topi transgenici che esprimono la proteina umana mutata e che sono considerati validi modelli sperimentali per studiare i meccanismi di degenerazione dei motoneuroni in quanto presentano  decorso clinico ed  alterazioni istopatologiche comparabili a quelli della SLA umana. Le ricerche su questa tematica, condotte su topi transgenici che esprimono SOD1 umana con una mutazione Glicina-Alanina in posizione 93 (Tg SOD1G93A) in collaborazione con la dott.ssa C. Bendotti (Laboratorio di Neurobiologia Molecolare, Istituto di Ricerche Farmacologiche Mario Negri, Milano) e il prof. A. Poletti (Centro di Eccellenza per lo Studio delle Malattie Neurodegenerative, Università di Milano) riguardano specificamente i seguenti aspetti:

1.1. Ruolo di alterazioni della proteolisi nella degenerazione dei motoneuroni in un modello murino di sclerosi laterale amiotrofica familiare

E’ da tempo noto che, sia nei pazienti affetti da SLA che nei modelli sperimentali, i neuroni vulnerabili contengono aggregati di proteine anomale il cui accumulo può provocare malfunzionamento e quindi morte dei neuroni stessi. Si può quindi ipotizzare che nella patologia siano implicate alterazioni dei meccanismi che normalmente presiedono alla degradazione delle proteine intracellulari. Ci proponiamo quindi di verificare se la degenerazione dei motoneuroni spinali sia legata ad un deficit nella degradazione proteica analizzando, nei topi Tg SOD1G93A usati come modello murino di SLA, l’attività di due sistemi proteolitici intracellulari: il proteasoma e il sistema autofagosoma/lisosomi.

1.2. Ruolo di alterazioni  dei mitocondri nella degenerazione dei motoneuroni in un modello murino di sclerosi laterale amiotrofica familiare

Varie evidenze sperimentali indicano che i mitocondri sono implicati nella patogenesi della SLA. Nei motoneuroni spinali di topi Tg SOD1G93A, usati come modello murino di SLA, abbiamo precedentemente riscontrato a livello ultrastrutturale alterazioni molto precoci a carico dei mitocondri. Ci proponiamo ora di caratterizzare la sequenza temporale di tali alterazioni mitocondriali durante la progressione della patologia, verificando anche alcuni parametri funzionali della attività mitocondriale ed esaminando, oltre al midollo spinale anche i nuclei motori del tronco encefalico.

FIG.1. Micrografia elettronica che mostra un mitocondrio alterato (freccia) nel soma di un motoneurone di un topo transgenico usato come modello di SLA

2. Trauma Spinale

De Biasi, Vitellaro, Fontana

Il trauma spinale è una patologia umana sfortunatamente molto frequente e devastante per la quale non esistono attualmente terapie efficaci. Per contribuire alla comprensione dei meccanismi neurodegenerativi secondari implicati in questa patologia, viene utilizzato un modello di trauma spinale contusivo in ratto o topo, messo a punto nel laboratorio del prof. A Gorio (Dipartimento di Medicina, Chirurgia e Odontoiatria, Università di Milano). Le ricerche su questa tematica riguardano specificamente la caratterizzazione del destino di cellule staminali trapiantate e del parenchima neurale del sito di lesione in un modello sperimentale di trauma spinale. Le cellule staminali sono potenzialmente un valido strumento per ripristinare la funzionalità del tessuto nervoso danneggiato a patto che sopravvivano, migrino nel sito di lesione e si integrino funzionalmente con il tessuto nervoso dell’ospite. Scopo della presente ricerca è pertanto di caratterizzare 1) localizzazione, entità dell’integrazione e differenziamento di cellule staminali neurali trapiantate nel midollo spinale di roditore dopo trauma contusivo, e 2) le molecole espresse a livello cellulare ed extracellulare nella zona di midollo spinale lesionato che circonda le cellule staminali neurali.

FIG. 2. Localizzazione immunocitochimica di un interneurone (IN) contenente parvalbumina (segnale verde) e di un motoneurone (MN, segnale blu) circondato da matrice extracellulare (segnale rosso) nel midollo spinale di ratto. Microscopia confocale.

3. L'innervazione colinergica nell’encefalo di roditore adulto e durante lo sviluppo

Amadeo, Pasini

E' noto che il sistema colinergico dell'encefalo contribuisce in modo importante alla regolazione delle transizioni tra gli stati cerebrali a diverso livello di attenzione. Inoltre, numerosi lavori recenti indicano che l'innervazione colinergica della corteccia e di altre regioni encefaliche partecipa a svariate altre funzioni, con implicazioni di rilievo in patologie del sistema nervoso, quali la schizofrenia, la sindrome di Alzheimer ed alcune forme epilettiche. Nonostante l'utilizzo crescente di modelli murini nelle neuroscienze e in neuropatologia, alcuni aspetti dell'organizzazione del sistema colinergico cerebrale nel topo rimangono ancora non del tutto compresi. I pochi studi comparativi rivelano differenze significative tra la struttura anatomica e l’organizzazione dei circuiti sinaptici nelle diverse specie di Mammiferi. Questo rende difficile l’interpretazione dei risultati ottenuti nei modelli murini di patologie neurologiche umane. Il nostro gruppo di ricerca si propone quindi di combinare analisi neuroanatomiche, condotte con metodi citochimici e immunocitochimici, allo studio dell'espressione genica per ottenere un quadro completo del sistema colinergico murino e per analizzare in maggior dettaglio alcune regioni encefaliche specifiche, quali la corteccia cerebrale, il talamo e il tronco cerebrale, nel topo adulto e a diversi stadi di sviluppo prenatale e postnatale.

FIG.3. Neurone marcato con biocitina nella neocorteccia di topo caratterizzato da un soma di tipo piramidale e da dendriti apicali e basali ricchi di spine. Barra = 20 um.

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