FISIOLOGIA MOLECOLARE E NEUROBIOLOGIA

Prof. Mirko Baruscotti, Prof. Dario Di Francesco, Prof. Michele Mazzanti, Dr. Andrea Barbuti, Dr. Enzo Mancinelli.

L'Unità di ricerca di Fisiologia Molecolare e Neurobiologia si occupa dell’analisi delle proprietà di diversi canali ionici. Il progetto di maggior interesse riguarda il canale pacemaker (“funny”), originariamente descritto nelle cellule “pacemaker” del nodo senoatriale (SAN) (Brown, DiFrancesco & Noble, 1979, Nature 280, 235) e caratterizzato negli anni successivi nei miociti cardiaci e nei neuroni. L’attività ritmica cardiaca è generata dalle cellule pacemaker, che nei mammiferi sono localizzate nel nodo senoatriale. Il potenziale d’azione delle cellule del nodo senoatriale presenta una particolare fase chiamata depolarizzazione diastolica (o pacemaker), che alla fine di un potenziale d’azione guida il potenziale di membrana fino alla soglia per la generazione di un nuovo potenziale d’azione, e quindi determina l’attività ritmica cardiaca. L’attivazione della If è il meccanismo che controlla la depolarizzazione pacemaker. La corrente If è anche modulata dal cAMP intracellulare, che rappresenta il meccanismo responsabile della modulazione della frequenza cardiaca da parte del sistema nervoso autonomo. Una corrente pacemaker simile a quella cardiaca è espressa anche nei neuroni (Ih). Nei neuroni sensoriali la Ih è coinvolta nella percezione degli stimoli esterni e nella modulazione della trasduzione di stimoli sensoriali in segnali elettrici. La Ih è espressa anche in membrane presinaptiche, dove contribuisce a fenomeni di plasticità. Nel nostro laboratorio vengono studiate le proprietà dei canali pacemaker e di altri tipi di canali ionici a vari livelli (singola cellula, singolo canale, cellule native, espressione eterologa), utilizzando le più avanzate tecniche di elettrofisiologia, biologia molecolare, biochimica, immunofluorescenza ed altre tecniche.
Un altro progetto riguarda la caratterizzazione di correnti di cloro coinvolte in numerosi tipi di condizioni patologiche. Vengono effettuati esperimenti su cellule muscolari, al fine di analizzare le diverse caratteristiche della permeabilità al cloro in patologie muscolari umane. Nelle cellule della micorglia, l’attenzione è puntata su una proteina intracellulare del canale del cloro, che viene attivata quando sono in corso processi neurodegenerativi.

Linee di Ricerca:

1. La corrente If

L’attività ritmica cardiaca è generata dalle cellule pacemaker, che nei mammiferi sono localizzate nel nodo senoatriale. Il potenziale d’azione delle cellule del nodo senoatriale presenta una particolare fase chiamata depolarizzazione diastolica (o pacemaker), che alla fine di un potenziale d’azione guida il potenziale di membrana fino alla soglia per la generazione di un nuovo potenziale d’azione, e quindi determina l’attività ritmica cardiaca. Qual è il meccanismo che controlla la depolarizzazione pacemaker?

Nel 1979, Brown, DiFrancesco e Noble, hanno descritto, nelle cellule pacemaker cardiache, la corrente “funny” (If), chiamata così a causa delle sue proprietà inusuali. Dal momento che questa corrente è entrante, e si attiva lentamente in iperpolarizzazione a voltaggi compresi nel range diastolico, gli autori hanno ipotizzato che potesse essere coinvolta nella generazione dell’attività spontanea; la corrente è inoltre aumentata dall’adrenalina, suggerendo un suo coinvolgimento nel meccanismo di accelerazione dell’attività pacemaker, e quindi del ritmo cardiaco, indotto dalle catecolamine. Questa corrente è stata descritta precedentemente anche in un’altra preparazione cardiaca che presenta attivtià spontanea, le fibre di Purkinje, ma è stata definita come pure corrente di potassio, uscente a voltaggi diastolici (corrente IK2, Noble & Tsien, 1968).

La corrente IK2 dell fibre del Purkinje è simile alla If nodale, per molti aspetti, e l’apparente natura ionica differente rimane un argomento dibattuto fino al 1981, quando venne proposta una reintepretazione della corrente IK2 (DiFrancesco 1981 a,b), dimostrando che le due correnti erano infatti identiche, e che la corrente IK2 è stata erroneamente interpretata per più di 10 anni come una pura corrente di potassio. Ciò ha dimostrato l’identità delle componenti pacemaker nelle diverse cellule cardiache. In seguito a questa prima descrizione, l’If è stata ampiamente caratterizzata nelle cellule cardiache (DiFrancesco, 1993). L’If è una corrente mista di Na+ e K+, che si attiva in iperpolarizzazione da una soglia di circa -40/-50mV. Alla fine di un potenziale d’azione, quando la membrana ripolarizza al di sotto di questa soglia, l’If viene attivata e fornisce corrente entrante, che è responsabile della generazione della fase di depolarizzazione diastolica. La corrente If è inoltre modulata dal cAMP intracellulare, mediante un’azione diretta sui canali-f e non mediata da fosforilazioni (DiFrancesco & Tortora, 1991). L’aumento di cAMP, sposta la curva di attivazione della If verso potenziali più positivi e quindi fornisce una maggior corrente entrante per la depolarizzazione pacemaker. Quest’azione è alla base della modulazione del ritmo cardiaco da parte del sistema nervoso autonomo. Nelle cellule cardiache, la sintesi di cAMP è stimolata e inibita dai β-agonisti e da agonisti muscarinici, rispettivamente; quindi, la stimolazione simpatica accelera e quella vagale rallenta il ritmo cardiaco, rispettivamente aumentando e diminuendo la corrente If ai potenziali diastolici mediante variazioni dei livelli di cAMP. Un’attività vagale moderata, come quella associata al tono vagale basale, controlla il ritmo cardiaco modulando la If e non, come si pensava precedentemente, attraverso l’apertura dei canali di potassio attivati dall’acetilcolina (DiFrancesco, Ducouret & Robinson, 1989).

La corrente If ha una conduttanza di singolo canale abbastanza bassa (circa 1pS, DiFrancesco, 1986). Il legame delle molecole di cAMP ai canali f induce un cambio conformazionale della proteina, associato ad un aumento della probabilità di apertura del canale in iperpolarizzazione (DiFrancesco & Mangoni, 1994). Questo meccanismo può essere interpretato in termini di attivazione allosterica del canale indotta da cAMP, secondo cui il cAMP si lega preferenzialmente, e quindi stabilizza, la configurazione “aperta” del canale (DiFrancesco, 1999). Correnti simili a If sono state descritte in varie preparazioni neuronali (corrente Ih, Pape, 1996). Generalmente, il ruolo della corrente Ih nei neuroni è basato sulla sua abilità di generare una depolarizzazione, in seguito sia a iperpolarizzazione della membrana, sia a modificazione dei livelli di cAMP intracellulari mediata da attivazione recettoriale. Quindi, la Ih può contribuire al controllo del potenziale di riposo, e alla modulazione dell’eccitabilità e alla frequenza di scarica. Nei neuroni sensoriali, la corrente Ih è coinvolta nella percezione degli stimoli esterni o nella modulazione della trasduzione degli stimoli sensoriali in segnali elettrici. La corrente Ih è anche espressa in alcune terminazioni pre-sinaptiche, dove è coinvolta in fenomeni di plasticità (Beaumont & Zucker, 2000; Mellor et al. 2002).

L’importanza dei canali-f nella generazione e controllo del ritmo cardiaco, ipotizza un loro possibile uso come target farmacologico. Sono state sviluppate numerose molecole che rallentano il ritmo cardiaco, capaci di indurre bradicardia senza effetti collaterali inotropici, come UL-FS, ZD 7288 e l’ivabradina. Le sostanze in grado di rallentare il ritmo in modo specifico, hanno un potenziale uso terapeutico in tutti quei casi in cui è utile rallentare il ritmo cardiaco senza alterare le altre funzioni vascolari.

Sono stati ottenuti sostanziali progressi nella conoscenza delle proprietà molecolari dei canali pacemaker con il clonaggio, alla fine degli anni ’90, della famiglia dei canali HCN (Hyperpolarization-activated, Cyclic-Nucleotide-gated). I canali HCN sono caratterizzati da una struttura simile a quella dei canali di potassio voltaggio-dipendenti (Kv) e ai canali modulati dai nucleotidi ciclici (CNG). Le proprietà dei canali HCN espressi in sistemi eterologhi mostrano che questi canali sono i determinanti molecolari dei canli pacemaker nativi nel cuore e nel sistema nervoso. 

2. Pacemaker biologico

Barbuti, Baruscotti, Brioschi, Bucchi, Crespi, Mandelli, Di Francesco.

Le aritmie cardiache sono patologie comuni che comprendono disordini complessi e multifattoriali del ritmo cardiaco. I casi di forte bradicardia (i.e., la diminuzione del ritmo cardiaco) e il blocco del nodo atrio-ventricolare spesso richiedono l’impianto di un pacemaker elettronico come unica terapia possibile. Lo scopo di questo progetto è quello di creare un substrato cellulare in grado di generare autonomamente attività spontanea ripetitiva e agire perciò da “pacemaker biologico; la sfida  ultima di questo progetto sarà l’impianto di un pacemaker biologico al posto dei dispositivi elettronici ad oggi utilizzati.
L’approccio è basato sul differenziamento in vitro di cellule staminali (embrionali o adulte) verso un fenotipo cardiaco, pacemaker-like, urante il quale le cellule sono guidate ad acquisire una serie di canali ionici e altre proteine necessarie a generare potenziali d’azione spontanei. La conferma funzionale di questa strategia comprende: a) caratterizzazione delle proprietà elettriche dei cardiomiociti derivati dalle cellule staminali (voltage- and current clamp); b) l’analisi dei canali ionici e di altre proteine senoatriali tramite RT-PCR, Western Blot e analisi confocale; c) valutazione dell’abilità di queste cellule di modificare e di guidare l’attività spontanea di una coltura primaria di cellule ventricolari.

3. Genetica delle patologie dei canali pacemaker

Barbuti, Baruscotti, Bottelli, Brioschi, Milanesi, Di Francesco.

Le patologie cardiache associate a disordini del ritmo hanno la maggior incidenza e rappresentano una delle maggiori cause di mortalità nei paesi occidentali. Negli ultimi anni, gli approcci molecolari apllicati alla ricerca cardiovascolare, hanno permesso di identificare molti difetti genetici che portano ad alterazioni della funzionalità cardiaca. Un lavoro recente del nostro gruppo ha identificato una mutazione nel gene hHCN4 (S672R), una isoforma umana del canale pacemaker, che è responsabile di una forma familiare di bradicardia (Milanesi et al. 2006). La ricerca è stata ora estesa a potenziali nuove mutazioni del gene hHCN4 in pazienti che presentano forme familiari di patologie cardiache sintomatiche ed ereditate, che affliggono attività pacemaker senoatriale. Il DNA genomico viene estratto dai pazienti e da individui sani e il gene hHCN4 viene amplificato per PCR. I frammenti di DNA vengono analizzati con SSCP, una tecnica che permette di identificare una mutazione a livello del singolo nucleotide, e/o polimorfismi in una sequenza. Una volta che l’analisi genetica è completata (origine familiare, analisi di linkage e così via), la mutazione di interesse viene espressa in vitro in un sistema eterologo (cellule HEK293), per permettere l’analisi funzionale attraverso esperimenti di patch-clamp e immunoluorescenza.

4. Farmacologia del canale pacemaker

Barbuti, Baruscotti, Bottelli, Bucchi, Milanesi, Di Francesco.

Le sostanze in grado di bloccare selettivamente il canale f hanno un potenziale uso terapeutico in tutti quei casi in cui è utile rallentare il ritmo cardiaco senza alterare altre funzioni cardiovascolari come la contrattilità ventricolare. Negli anni passati, sono state sviluppate diverse molecole in grado di bloccare i canali pacemaker, come la zetabradina, lo ZD7288 e l’ivabradina, ma solo l’ivabradina ha superato tutti i trias clinici ed è attualmente commercializzata come farmaco antiangina in diversi stati, con il nome commerciale di Procoralan. Il suo effetto benefico consiste in un rallentamento selettivo del ritmo cardiaco, senza significative azioni avverse come una riduzione dell’ inotropismo, effetto collaterale tipico di inibitori del ritmo meno specifici, come i beta-bloccanti o i calcio-antagonisti. L’azione inibitoria sul ritmo cardiaco dell’ivabradina è dovuta a un blocco selettivo dei canali f. Il nostro gruppo ha dimostrato che l’ivabradina blocca la If senoatriale in modo uso- e corrente- dipendente (Bucchi et al., 2002). La caratterizzazione dell’effetto bloccante dell’ivabradina è stata inoltre estesa alle isoforme HCN1 e HCN4 (Bucchi et al. 2006). Ciò ha rivelato differenze inaspettate nel meccanismo di blocco delle due isoforme: mentre l’ivabradina si comporta come un bloccante a “canale aperto” per i canali f nativi e HCN4, per i canali HCN1 si comporta come bloccante “a canale chiuso”. Le differenze nel modo di azione di questa molecola possono essere sfruttate per sviluppare nuove molecole con una più alta specificità per le diverse isoforme.

5. Localizzazione a livello della membrane dei canali HCN

Barbuti, Baruscotti, Brioschi, Bucchi, Crespi, Mandelli, Di Francesco.

Questa linea di ricerca ha lo scopo di investigare la localizzazione subcellulare dei canali HCN, la loro interazione con i microambienti cellulari e i meccanismi attraverso i quali queste interazioni modificano le proprietà funzionali dei canali. Un precedente studio del nostro gruppo ha dimostrato che i canali f nativi localizzano in microdomini di membrana (lipid raft/caveolae) e che questa localizzazione è importante per una corretta funzione (Barbuti et al. 2004). Usando un approccio combinato basato su protocolli biochimici (immunocitochimica, co-immunoprecipitazione e western blot) e su la tecnica del patch-clamp, stiamo valutando la rilevanza della localizzazione caveolare dell’HCN4 in relazione alla modulazione del canale da parte dell’attivazione di specifici β1 o β2 recettori adrenergici (Barbuti et al. 2006). Inoltre, dal momento che i canali HCN possiedono un dominio di interazione per la caveolina, stiamo investigando gli effetti di mutazioni nella sequenza consensus sulle proprietà del canale e sulla sua localizzazione. I risultati di questa ricerca potranno aiutare a chiarire i meccanismi che regolano la funzione dei canali HCN nella cellula.

6. Distrofia Miotonica di tipo 2

Mancinelli, Cardani.

La Distrofia Miotonica di tipo 2 (DM2) è una patologia a trasmissione autosomica dominante e multisistemica causata dall'espansione abnorme della tetrapletta CCTG dell'introne 1 del gene della ZFP9. I trascritti mutati si accumulano nei nuclei delle fibre muscolari formando inclusioni ribonucleari. La tecnica dell'ibridazione in situ fluorescente (FISH) con lo specifico probe (CAGG)₅ è usata a scopo diagnostico sulle biopsie muscolari per evidenziare tali inclusioni. Le caratteristiche istopatologiche del tessuto muscolare nella DM2 sono l'atrofia preferenziale delle fibre di tipo 2 e la presenza di nuclear clumps, costituiti da accumulo di nuclei di origine non nota. Attualmente sono in corso studi di immunoistochimica utilizzando numerosi markers con lo scopo di capire se l'atrofia sia dovuta a processi degenerativi o a difetti nel differenziamento, e l'origine dei nuclear clumps.
Le proteine della famiglia Muscleblind (MBNLs) sono delle CUG/CCUG RNA-binding proteins che sembrano coinvolte nei difetti di splicing delle distrofie miotoniche. In effetti con la tecnica combinata della FISH e dell'immunofluorescenza si osserva colocalizzazione tra i foci ribonucleari accumulati nel nucleo e MBNL, indicando che le espansioni ripetute della tetrapletta CCUG possono portare, attraverso il sequestro di MBNL, a un'aberrante regolazione dello splicing alternativo di numerosi geni tra cui quello per ClC-1 e per il recettore dell'insulina, producendo miotonia, resistenza all'insulina e difetti di conduzione cardiaca, sintomatici delle distrofie miotoniche.
In collaborazione con: Prof. Giovanni Meola, Università degli Studi di Milano, Dipartimento di Scienze Medico Chirurgiche, I.R.C.C.S. Policlinico San Donato, San Donato Milanese (MI); Prof. Giuseppe Novelli, Università degli Studi di Roma "Tor Vergata", Dipartimento di Biopatologia e Diagnostica per Immagini, Roma. 

7. Studi in vitro delle patologie neuromuscolari

Mancinelli, Cardani.

La debolezza muscolare e la progressività dalla sintomatologia sono gli aspetti più debilitanti di numerosi disordini neuromuscolari e possono originare da una risposta rigenerativa inadeguata al danno muscolare. Il differenziamento dei mioblasti è essenziale per la rigenerazione del muscolo. Mioblasti ottenuti da biopsie umane e differenziati in vitro fondono, dopo numerose divisioni, a formare miotubi multinucleati. Il grado di differenziamento è determinato dalla presenza di espressione di differenti markers del differenziamento muscolare (MyoD, Miogenina, Miosine fast e slow), che si possono evidenziare utilizzando l'immunofluorescenza e il Western blot. Utilizzando mioblasti in coltura ottenuti da biopsie di pazienti adffetti da distrofia miotonica di tipo 2 (DM2) è possibile studiare le interazioni tra il trascritto mutante contenente i repeats CCUG, caratteristico della DM2, e proteine di tipo muscleblind (MBNLs), fattore di splicing alternativo. L'alterata funzione di MBNL, dovuta al sequestro da parte del repeat CCUG espanso, potrebbe essere implicata nella patogenesi della DM2. Pertanto le colture cellulari di mioblasti DM2 possono essere un buon modello sperimentale per lo studio dello splicing alternativo di numerosi geni, quali quelli di ClC-1, della troponina cardiaca T, del recettore dell'insulina, della proteina t, e per la verifica se MBNL può essere un target efficace per un auspicabile approccio terapeutico.
In collaborazione con: Prof. Giovanni Meola, Università degli Studi di Milano, Dipartimento di Scienze Medico Chirurgiche, I.R.C.C.S. Policlinico San Donato, San Donato Milanese (MI); Prof. Giuseppe Novelli, Università degli Studi di Roma "Tor Vergata", Dipartimento di Biopatologia e Diagnostica per Immagini, Roma. 

8. Correnti di membrana in miotubi umani

Mancinelli, Cardani.

I miotubi umani, ottenuti dalle cellule satelliti isolate da biopsie di pazienti affetti da DM2 e posti in coltura per 25-30 giorni in terreno opportuno, sono altamente differenziati, come indicato da contrazioni spontanee, dalla presenza di striature e dall'organizzazione in sarcomeri, e producono, se opportunamente stimolate delle correnti di cloro, di potassio e di sodio: essi rappresentano un buon modello per lo studio della miotonia, un fenotipo tipico della DM2. Con la tecnica del patch- clamp nella configurazione whole- cell è possibile caratterizzare le correnti di cloro, potassio e sodio, implicate nel fenomeno dell'eccitabilità, e studiare l'effetto su tali correnti di droghe antimiotoniche, al fine di individuare una terapia adeguata per il fenotipo mioptonico.

9. Canale del cloro intracellulare: relazione tra struttura e funzione, inserimento in membrana e modulazione 

Mazzanti.

Una classe crescente di proteine intracellulari eucariotiche funziona sia come proteine solubili sia come proteine integrali di membrana. Una proteina del genere è CLIC1, e appartiene a una nuova classe di canali del cloro prevalentemente intracellulari composta da 7 membri. CLIC1 è altamente conservata, ha un’ampia distribuzione tissutale, e la sua inibizione blocca il ciclo cellulare. Noi abbiamo determinato la prima struttura cristallizzata della forma solubile di CLIC1. Più recentemente, abbiamo dimostrato che le condizioni ossidanti sono essenziali per la formazione attiva del canale CLIC1 e che la forma solubile subisce un drammatico cambiamento strutturale dopo ossidazione. Il nostro scopo è quello di capire le due inusuali proprietà di CLIC1: la sua abilità di transitare dalla forma solubile a quella integrale di membrana e il ruolo dei meccanismi di ossidoriduzione nel controllo di questo processo. Il nostro obbiettivo sarà quello di determinare: la struttura della forma integrale di membrana di CLIC1, il meccanismo e il controllo del processo di trasformazione dalla forma solubile a quella integrata, la visualizzazione e il controllo dell’attività del canale ionico CLIC1. A tal fine, useremo una combinazione di elettrofisiologia, biologia cellulare e molecolare, cristallografia a raggi X, microscopia a forza atomica, EPR e spettroscopia a fluorescenza. CLIC1 rappresenta una proteina ideale per studiare la difficoltà e i problemi fondamentali dell’inserimento in membrana e la relazione struttura/funzione di un canale ionico. 

10. Attivazione della miroglia e processi neurodegenerativi

Mazzanti. 

E’ ampiamente noto che gli eventi infiammatori mediati dall’attivazione della microglia contribuiscono a processi neurodegenerativi gravi. Il morbo di Alzheimeir, per esempio, è caratterizzato da un accumulo della proteina b-amiloide (A b) nelle placche neuritiche che sono infiltrate dalla microglia reattiva e dagli astrociti. La  A b e il suo frammento 25-35 oltre ad esercitare un effetto tossico diretto sui neuroni, attivano anche la microglia. L’attivazione della microglia è accompagnata da cambiamenti morfologici, proliferazione cellulare e rilascio di numerose citochine e fattori di crescita. Un certo numero di lavori scientifici, suggerisce che l’aumento della proliferazione delle cellule microgliali è dipendente da correnti ioniche di membrane, e in particolare dalle conduttanze di cloro. Un canale ionico particolare, noto per essere associato all’attivazione dei macrofagi, è il canale del cloro intracellulare 1 (CLIC1). Abbiamo recentemente dimostrato che una stimolazione  della microglia di ratti neonati con A b, porta in modo specifico ad un aumento della proteina CLIC1 e all’espressione di canali di cloro CLIC1 funzionanti, entrambi appena rilevabili sulla membrana plasmatica delle cellule quiescenti. L’espressione della proteina CLIC1 nella microglia aumenta, dopo 24h di incubazione con A b, contemporaneamente alla produzione di prodotti reattivi derivati dall’azoto e di tumor necrosis factor-a (TNF-a). Abbiamo dimostrato che la riduzione della conduttanza al cloro CLIC1 attraverso uno specifico bloccante previene l’apoptosi neuronale in neuroni in co-coltura con microglia trattata con A b. Inoltre, abbiamo mostarto che gli “small interfering RNA” usati per spegnere l’espressione di CLIC1 prevengono il rilascio di TNF-a  indotto dalla stimolazione con A b. Questi risultati forniscono un collegamento diretto tra l’attivazione microgliale indotta da A b e l’espressione funzionale di CLIC1. 

11. Effetto dell’esposizione a campi elettromagnetici su cellule neuronali ad alta e bassa frequenza  

Mazzanti. 

Il nostro progetto consiste in esperimenti di elettrofisiologia condotti su cellule neuronali esposte a campi elettromagnetici di diversa frequenza e intensità. Gli esperimenti sono in corso sia con campi magnetici a bassa frequenza sia con quelli ad alta frequenza. In questo contesto lo scopo principale di questo progetto è quello di stimare il possibile effetto biologico e i rischi dell’esposizione delle cellule nervose a campi elettromagnetici, emanati da sistemi di comunicazione senza fili, in modo specifico i sistemi globali per la comunicazione mobile GSM 900 MHz e GSM 1800 MHz (telefoni cellulari) e i nuovi sistemi di comunicazione come UMTS che vanno oltre i meccanismi di interazione termica. Questo studio tiene anche conto del fatto che recentemente si è prestata molta attenzione ai campi magnetici a 217Hz, che risultano da correnti pulsate che fluiscono dalle batterie, con una frequenza principale simile a quella GSM.

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