FISIOLOGIA MOLECOLARE E DEI TRASPORTI 

Prof. Giuliano Meyer, Prof. Maria Novella Orsenigo.

Le tematiche di Fisiologia Molecolare, nell’ambito delle linee di ricerca di cui si occupa questa Unità, si fondano sullo studio dei rapporti struttura/funzione di molecole trasportatrici di membrana e sulle loro diverse regolazioni; ad esempio, studiamo il coinvolgimento della proteina ICln, un canale ionico clonato da una linea cellulare renale canina, nella regolazione del volume cellulare. Nell’ambito della Fisiologia dei Trasporti conduciamo studi funzionali  anche mediante analisi a livello molecolare dei meccanismi di trasporto presenti in membrane di cellule non eccitabili. Stiamo analizzando le regolazioni dei trasporti di membrana in funzione dell’omeostasi cellulare e degli assorbimenti e secrezioni transepiteliali. Il nostro laboratorio ha una lunga esperienza nelle tecniche di elettrofisiologia, radiochimica, fluorimetria e biologia molecolare.

Linee di Ricerca:

Fisiologia Molecolare:

1. Il  PH domain diICln e l’interazione con i fosfatidilinositoli

Meyer, Bazzini

In molti tipi cellulari, il rigonfiamento coincide con un aumento dell’attività della fosfatidilinositolo -3-kinasi (PI-3-K). In particolare, con esperimenti di patch-clamp, abbiamo osservato che il trattamento delle cellule con inibitori della PI-3-K inibisce l’efflusso di ioni stimolato dal rigonfiamento cellulare. La forma idrosolubile di ICln include un dominio PH (fig. 1). Questo dominio è coinvolto nella interazione con altre proteine e nel legame con i fosfatidilinositoli (PtdIns), suggerendo un possibile ruolo dei PtdIns nella traslocazione di ICln verso la membrana e nell’attivazione della corrente ICl,swell.
Su queste basi, stiamo attualmente studiando le interazioni tra ICln e diversi tipi di PtdIns, soprattutto 3-fosfoinositoli, utilizzando tecniche di indagine in vitro (esperimenti di protein overlay, binding a liposomi) e approcci in vivo (patch-clamp, FRET).

Fig. 1: struttura del dominio PH di ICln e profilo di idropaticità dei suoi componenti aminoacidici.

2. Proteine interagenti con ICln

Meyer, Vezzoli, Bazzini

ICln, oltre al suo ruolo nella regolazione del volume cellulare, svolge altre funzioni quale regolatore della morfologia cellulare, dell’attivazione piastrinica e del processamento dell’RNA. La scoperta che ICln interagisce con proteine citosoliche, di membrana o associate alla membrana suggerisce che possa funzionare da connettore tra varie vie regolatrici e compartimenti intracellulari. Per comprendere meglio la funzione di ICln, stiamo lavorando per identificare le proteine con essa interagenti, sia nella frazione citosolica, sia nella frazione di membrana, e stiamo determinando come l’intero proteoma della cellula cambi durante il fenomeno del decremento regolatore del volume cellulare.
In particolare, intendiamo indagare da un punto di vista funzionale e molecolare l’interazione tra ICln e la catena alfaIIB dell’integrina piastrinica e una proteina zink finger dalla funzione ancora sconosciuta, chiamata HSPC038. Questi esperimenti potrebbero essere di aiuto nella delucidazione del meccanismo che conduce alla trasposizione di ICln verso il plasmalemma durante il decremento regolatore del volume cellulare, così come il ruolo delle proteine interagenti con ICln nell’attivazione della corrente anionica attivata da rigonfiamento cellulare (ICl,_swell).

3. ICln e apoptosi

Meyer, Bazzini

La proliferazione cellulare e l’apoptosi sono processi biologici di base che permettono di creare nuove cellule e di eliminare cellule danneggiate per assicurare la crescita e il mantenimento di un organo. L’apoptosi è un processo complesso, che prevede numerosi eventi che alla fine conducono alla morte cellulare. Un evento chiave precoce è l’attivazione di una corrente anionica molto simile alla ICl,_swell (swelling activated chloride current). L’attivazione della corrente causa un efflusso di ioni e un consequente restringimento del volume cellulare, processo conosciuto come Apoptotic Volume Decrease (AVD, Fig. 2). Poichè ICln è essenziale per l’attivazione della ICl,swell, stiamo investigando la relazione tra ICln, la corrente coinvolta nell’AVD, l’apoptosi e la proliferazione cellulare. Il progetto prevede l’uso di saggi di vitalità e misure dell’attivazione di diversi eventi chiave dell’apotosi, utilizzando cellule che over-esprimono ICln o dopo silenziamento della sua espressione tramite RNAi.

4. Regolazione della trascrizione del gene codificante per ICln

Meyer, Bazzini, Vezzoli

Mediante analisi bioinformatica abbiamo individuato, a monte del gene codificante per la proteina ICln, un elemento comune a proteine che partecipano a processi fisiologici quali l’apoptosi, e, in generale, la risposta agli stress cellulari. Intendiamo perciò stabilire se tale sequenza sia importante nella regolazione dell’espressione di ICln durante il decremento regolatore del volume cellulare.

Fig. 2 Meccanismi ionici della regolazione del volume cellulare e dell’induzione dell’apoptosi

Fisiologia dei Trasporti:

1. L’ipertensione essenziale: alterazioni funzionali e molecolari dei canali ionici del nefrone distale

Meyer, Garavaglia

L’ipertensione essenziale è strettamente associata ad un aumentato riassorbimento renale di Na+. Questo porta ad ipervolemia, che rappresenta un passaggio cruciale nello sviluppo dell’ipertensione.
I tratti distali del nefrone (tratto spesso ascendente, tubulo convoluto distale e dotto collettore) sono le zone in cui avviene assorbimento attivo di NaCl, seguito da riassorbimento facoltativo di acqua, come conseguenza del gradiente osmotico generato. Dato che i canali ionici sia della membrana apicale che della basolaterale sono funzionalmente connessi con i trasporti elettroneutri per il riassorbimento di NaCl nel nefrone distale, le modifiche ai cotrasportatori potrebbero essere associare ad un’alterata espressione e/o funzione dei canali ionici. Stiamo studiando le possibili alterazioni funzionali di questi canali ionici in ratti Milano ipertesi (MHS), un sistema modello per l’ipertensione essenziale nell’uomo.

2. Effetto della carbocisteina sale di lisina monoidrato sulla secrezione di glutatione da parte dell’epitelio respiratorio

Meyer, Garavaglia

Il glutatione (GSH) è uno dei più importanti agenti antiossidanti presenti nei fluidi corporei e a livello delle vie aeree superiori. Le secrezioni cellulari di GSH implicano un coinvolgimento del canale anionico CFTR (Cystic Fibrosis Trasmembrane Regulator). Il mucoregolatore Carbocisteina sale di Lisina Monoidrato (S-CMC-Lys) stimola la secrezione sia di Cl- che di GSH in cellule di epitelio respiratorio umano esprimenti il canale CFTR. Questa Unità di Ricerca studia gli effetti della S-CMC-Lys, sulla secrezione e produzione di glutatione in cellule respiratorie umane anche in condizioni di stress ossidativo, utilizzando tecniche  fluorimetriche ed elettrofisiologiche (patch-clamp).

3. Caratterizzazione molecolare e funzionale della Pendrina umana

Meyer, Bazzini, Vezzoli

La Pendrina è una proteina di membrana con funzione di scambiatore anionico, clonata di recente; è espressa principalmente nella tiroide, nel rene e nell’orecchio interno. Gioca un ruolo fondamentale per il corretto sviluppo dell’orecchio interno e per la biosintesi degli ormoni tiroidei. Mutazioni della proteina causano la sindrome di Pendred, una malattia autosomica recessiva caratterizzata da sordità neurosensoriale e da un parziale difetto dell’organigazione dello ioduro, che può condurre allo sviluppo di gozzo tiroideo e ipotiroidismo.
Stiamo studiando i meccanismi trascrizionali che portano all’espressione del gene della Pendrina, caratterizzandone la regione promotrice in diverse linee cellulari. Inoltre, stiamo effettuando esperimenti (mediante western blot, immunoistochimica, analisi dei trasporti mediante traccianti fluorescenti e radioattivi, ecc.) per caratterizzare molecolarmente e funzionalmente la Pendrina wild type e alcuni mutanti naturali identificati in pazienti con sindrome di Pendred. Questi studi sono volti all’individuazione di meccanismi (proteine chaperon, farmaci, condizioni fisiche) che possano ripristinare la funzione corretta nelle proteine mutate.

Fig. 3 Espressione della pendrina esogena in cellule HEK293-Phoenix. La localizzazione subcellulare è stata fatta coesprimendo la pendrina (segnale rosso) con un marcatore della membrana plasmatica ( segnale verde).

4. Effetto dello stress ossidativo su diversi parametri funzionali dell’intestino tenue

Orsenigo, Tosco

Molti dei parametri che rispecchiano “stress ossidativo” sono stati studiati nell’intestino per la sua particolarità di essere esposto ad agenti ossidanti di origine sia esogena (dieta e lume) che endogena (mucosa). Nei tratti digiunale e ileale dell’intestino tenue di ratto si vuole indagare l’effetto di diversi agenti ossidanti sull’attività della (Na+, K+)-ATPasi, responsabile del trasporto transepiteliale dello ione Na+, e della γ-GT, enzima coinvolto nell’omeostasi del glutatione. Inoltre si verificheranno possibili effetti diretti degli stessi agenti ossidanti sui singoli meccanismi implicati nel trasporto transepiteliale di fluido, glucosio, sodio, cloruri e lattato localizzati sia sulla membrana apicale che sulla membrana basolaterale.

5. La capacità antiossidante dell’enterocita di ratto in condizioni di acidosi acuta e cronica

Orsenigo, Tosco

Lo stress ossidativo è notoriamente coinvolto nell’instaurarsi di diverse patologie del tratto gastrointestinale caratterizzate da infiammazione cronica; lo stato infiammatorio è generalmente accompagnato da condizioni di acidosi che, a loro volta, inducono stress ossidativo e/o ne amplificano gli effetti. Questa ricerca si propone di chiarire, con approcci sperimentali diversificati, come stati di acidosi possano influenzare il potere antiossidante della cellula epiteliale e la sua risposta a diverse specie reattive dell’ossigeno in digiuno e ileo di ratto. Si valuterà se l’acidosi, acuta e cronica, influenzi il grado di perossidazione lipidica, indice di danno ossidativo, l’attività di enzimi coinvolti nella difesa antiossidante cellulare (γ-GT, catalasi, glutatione perossidasi, glutatione reduttasi, superossido dismutasi) e l’espressione di heat shock proteins, proteine coinvolte nei meccanismi citoprotettivi. Per valutare eventuali effetti dell’acidosi sulla funzionalità dell’intestino tenue di ratto, si  prenderanno in esame l’espressione della  (Na+, K+)-ATPasi e dei trasportatori di glucosio SGLT1 e GLUT2.

6. Ruolo protettivo della creatina sulla mucosa dell’intestino tenue in acidosi e in ipossia

Tosco, Orsenigo

La creatina è un derivato aminoacidico con una notevole rilevanza nel metabolismo energetico di molti tipi cellulari, poiché appartiene ad un sistema di riserva energetica in grado di provvedere al rifornimento di ATP. La creatina è assunta oralmente da molti atleti per migliorare le prestazioni e la massa muscolare; inoltre il suo uso è stato esteso al campo medico per prevenire o trattare patologie mitocondriali, neuromuscolari, cardiovascolari e cerebrali, o anche come agente antitumorale e antivirale. Recentemente è stato anche suggerito che la creatina protegga i tessuti da stress ossidativo. Obiettivo della ricerca è di indagare gli effetti della creatina sull’attività dei principali enzimi coinvolti nella difesa antiossidante degli enterociti digiunali e ileali di ratto, sia in condizioni fisiologiche, che in acidosi acuta e cronica, che in ipossia e anossia. Inoltre si  vuole valutare se la presenza di creatina, in tutte le condizioni citate, possa incidere su parametri associati al danno ossidativo, quali il livello di perossidazione lipidica. Infine per chiarire se la creatina possa avere comunque effetti citoprotettivi in relazione a condizioni di stress, si indagherà se la sua presenza potenzi l’espressione di heat shock proteins.

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