La nostra Unità di ricerca si occupa da diversi anni dello studio delle funzioni delle piccole GTPasi nella trasduzione del segnale neuronale. Numerosi dati documentano che le piccole GTPasi Ras e Ras-simili giocano un ruolo fondamentale nei meccanismi cellulari e molecolari, come la plasticità strutturale e sinaptica, che sono alla base dei processi di apprendimento e di formazione della memoria. Si è dimostrato che queste proteine sono implicate in numerosi processi che modulano la risposta sinaptica, come il controllo dei profili di espressione genica, e più di recente anche nella regolazione della sintesi proteica globale e locale.
In particolare per caratterizzare queste vie stiamo utilizzando una molecola attivatrice a monte, RasGRF1,  uno scambiatore dei nucleotidi guaninici che agisce su Ras e Rac.
Nel passato abbiamo generato dei topi knock-out per RasGRF1. Questi topi hanno dei difetti di plasticità sinaptica a lungo termine e di consolidamento della memoria,  mostrano una eccitabilità neuronale intrinseca più elevata, e non diventano tolleranti agli effetti locomotori indotti dai cannabinoidi. Questi topi rappresentano quindi un interessante e importante modello per i nostri studi. La disponibilità di strumenti necessari per svolgere studi di proteomica ci hanno recentemente permesso di aprire un nuovo campo di ricerca, in collaborazione con il Prof. Meola e il Dott. E. Mancinelli, finalizzato all’identificazione di alterazioni nel proteoma di miotubi ottenuti da biopsie di pazienti affetti da distrofia miotonica di tipo 2 confrontati con miotubi controllo.

Linee di Ricerca:

1. Il network e le interazioni molecolari di RasGRF1 nel neurone 

Zippel, Morella

I principali processi cellulari sono eseguiti nella cellula grazie alla formazione/dissociazione di numerosi complessi in cui le proteine interagiscono in modo dinamico. Con lo scopo di chiarire la rete di interazioni in cui è coinvolto RasGRF1, abbiamo utilizzato un approccio di tecniche biochimiche combinato con lo screening dei due ibridi in lievito per identificare nuovi partner molecolari di RasGRF1. Utilizzando dei saggi di precipitazione per affinità abbiamo isolato diverse RNA binding proteins (RBP) che interagiscono con la porzione N-terminale di RasGRF1. Inoltre abbiamo verificato una capacità inattesa di questa molecola di legare RNA in saggi di interazione in vitro. Questi dati ci rivelano delle nuove proprietà di RasGRF1 e indicano un suo potenziale ruolo in diversi aspetti del metabolismo dell’RNA, che sono attualmente oggetto di indagine nel nostro laboratorio. Il saggio del doppio ibrido ha inoltre portato all’identificazione di una interazione finora sconosciuta tra RasGRF1 e SCLIP, una proteina neuronale coinvolta nella regolazione della dinamica dei microtubuli. Abbiamo trovato che SCLIP inibisce RasGRF1 nella sua capacità di attivare i suoi target a valle, Ras e p38 MAPK, e di promuovere la formazione di neuriti in un sistema modello di differenziamento neuronale. Questi dati mettono in luce un nuovo collegamento tra RasGRF1 e la regolazione del citoscheletro, e trovano ulteriori conferme nei nostri dati più recenti che indicano una interazione diretta tra RasGRF e i microtubuli. Stiamo ora lavorando su un nuovo partner molecolare di RasGRF1 identificato tramite saggio del doppio ibrido con esperimenti volti a comprendere il ruolo funzionale di questa associazione.
L’integrazione di tutte queste informazioni ci darà successivamente una visione più globale del ruolo di RasGRF nella trasduzione del segnale nel neurone.

2. Ruolo di RasGRF1 nella signaling neuronale: confronto tra topi wild type e KO per RasGRF1 tramite colture organotipiche di cervelletto e fettine di cervelletto di topo adulto 

Zippel, Morella, David, Camaleonti

I topi KO per RasGRF1 mostrano difetti comportamentali in funzioni che coinvolgono diverse aree cerebrali. Ci siamo focalizzati in particolare sul cervelletto: quest’area cerebrale è coinvolta nel controllo dell’attività locomotoria e inoltre partecipa nel mantenimento a lungo termine della memoria avversiva (Sacchetti B., Scelfo B. e Strata P. Neuroscience 162,756  2009). Sebbene i topi KO per RasGRF1 non mostrino difetti evidenti nell’attività locomotoria nel test Rotarod, abbiamo trovato alterazioni in alcuni processi biochimici nel cervelletto e cambiamenti elettrofisiologici a livello delle sinapsi tra le fibre parallele e le cellule del Purkinjie. Allo scopo di studiare ulteriormente le differenze tra i topi wild type e KO per RasGRF1 abbiamo svolto recentemente un’analisi funzionale del proteoma e i dati ottenuti suggeriscono che i topi KO potrebbero avere diverse funzioni biologiche alterate. Stiamo ora mettendo a punto nuovi esperimenti utilizzando sia colture organotipiche di cervelletto sia fettine di cervelletto di topi adulti al fine di raccogliere informazioni sulle possibili alterazioni molecolari nella signalling neuronale e nella risposta a diverse condizioni di stress nei topi KO.

3. Analisi proteomica e studi funzionali sui miotubi e sui fibroblasti ottenuti da biopsie di pazienti affetti da Distrofia Miotonica di tipo 2

Zippel, Rusconi in collaborazione con Meola e Mancinelli e Cardani

L’esperienza tecnica e la disponibilità della tecnologia strumentale per gli studi di proteomica ci hanno permesso di aprire un nuovo campo di ricerca, in collaborazione con il Prof. Meola e il Dott. E. Mancinelli, finalizzato all’identificazione di cambiamenti nel proteoma di miotubi ottenuti da colture di cellule satellite derivate da biopsie di pazienti DM2. Questo modello cellulare può fornire sufficiente materiale biologico consentendoci un’analisi ad ampio spettro che non potrebbe essere condotta sulla piccola quantità di tessuto ottenuto da una biopsia di muscolo. Dai risultati derivanti dall’analisi proteomica emergono alterazioni in alcuni specifici compartimenti subcellulari a in funzioni biologiche che potrebbero essere rilevanti per la fisiopatologia della DM2. Stiamo ora studiando queste alterazioni funzionali mediante l’utilizzo di mioblasti e fibroblasti ottenuti da biopsie di pazienti DM1, DM2 e controlli.

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